慢病毒转染胸苷磷酸化酶基因增强5′–脱氧氟尿苷抗结肠癌细胞活性

作者：叶钿均; 王绮雯; 张继民^*; 刘奇

来源：中华肿瘤杂志, 2015, 37(01): 18-24.

• 结直肠肿瘤
• 胸苷磷酸化酶
• 转染
• 5′–脱氧氟尿苷
• 氟尿嘧啶

目的探讨5′–脱氧氟尿苷(5′–DFUR)和氟尿嘧啶(5–Fu)对人结肠癌细胞株HT29和LS174T转染胸苷磷酸化酶(TP)基因前后抗癌效应的变化。方法构建包含TP基因的慢病毒载体, 转染结肠癌细胞株HT29和LS174T。传代5代后, 以流式细胞术检测转染效率。免疫组织化学染色和Western blot检测转染TP基因前后HT29和LS174T细胞中TP蛋白的表达, 逆转录聚合酶链反应(RT–PCR)法检测细胞中TP mRNA的表达水平, 四唑氮化合物法检测5′–DFUR和5–Fu对转染TP基因前后细胞株的半数抑制浓度(IC50), 高效液相色谱(HPLC)法检测HT29和LS174T在细胞转染TP基因前后转化5′–DFUR为5–Fu的水平。结果转染TP基因的HT29和LS174T细胞传代5代后, 转染效率稳定在约95.0%。转染TP基因的HT29和LS174T细胞中TP表达阳性, 而野生型细胞和仅转染病毒载体细胞中TP表达阴性;Western blot结果显示, HT29和LS174T细胞中TP蛋白的表达明显增强。RT–PCR结果显示, 转染TP基因的HT29和LS174T细胞中TP mRNA的相对表达水平分别为8.45±0.15和2 615.02±253.97, 与野生型细胞比较, 差异均有统计学意义(均P<0.01)。5′–DFUR对转染TP基因的HT29–TP细胞和野生型细胞的IC50分别为(14.33±0.74)μmol/L和(707.66±5.66)μmol/L(P<0.05);对转染TP基因的LS174T–TP细胞和野生型细胞的IC50分别为(0.59±0.11)μmol/L和(239.20±21.83)μmol/L(P<0.05)。5–Fu对转染TP基因的HT29–TP细胞和野生型细胞的IC50分别为(5.42±0.75)μmol/L和(14.19±0.97)μmol/L(P<0.05);对转染TP基因的LS174T–TP细胞和野生型细胞的IC50分别为(4.41±0.96)μmol/L和(16.42±2.12)μmol/L(P<0.05)。转染TP基因后的HT29和LS174T细胞培养基中, 则检出大量转化的5–Fu, 较转染前分别增加了12.2～23.6倍, 差异均有统计学意义(均P<0.01)。在细胞裂解液中也检出有少量5–Fu, 但其水平仅相当于培养基中的0.9%～4.2%。结论以慢病毒为载体将TP基因转染至人结肠癌细胞HT29和LS714T, 能得到转染效率高和稳定传代的细胞株, 并且2株细胞的TP蛋白和TP mRNA的表达水平明显增高。转染后在培养基中转化的5–Fu水平明显增高, 使5–Fu和5′–DFUR对HT29和LS714T细胞的抗癌作用明显增强, 但5′–DFUR增强效果更加明显。

• 单位
  广州医科大学附属第二医院