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摘要
为构建猫杯状病毒(FCV) HRB-SS株的感染性克隆，本研究合成3’端含有丁肝病毒核酶(HdvRz)序列的HRB-SS株全长基因组序列，将该序列插入p OK12-CMV载体，获得含FCV HRB-SS全长基因组cDNA克隆的重组质粒p FCV-HRB-SS。将重组质粒p FCV-HRB-SS转染猫肾细胞(CRFK),48 h即可观察到典型细胞病变，将病变细胞的上清接种未感染的CRFK细胞进行传代培养，连续传5代，从感染的细胞上清中获得拯救病毒。采用FCV VP1蛋白MAb，经间接免疫荧光试验检测，结果显示拯救病毒与亲本病毒均可观察到特异性绿色荧光，而未感染病毒的对照组细胞无荧光信号；各组细胞负染色后经电镜观察均可见病毒粒子呈典型的杯状结构。提取拯救病毒和亲本病毒基因组RNA，反转录为c DNA作为模板，经RT-PCR扩增、Kpn I酶切鉴定及测序分析，结果显示，拯救病毒含C5724G位点突变的分子标记，消除了Kpn I酶切位点，不同于亲本病毒。上述结果表明获得拯救病毒r FCV HRB-SS。采用蚀斑形成试验和绘制病毒的一步生长曲线进一步检测r FCV HRB-SS，结果显示，r FCV HRB-SS与亲本病毒具有一致的复制水平和体外生长能力。本研究利用真核启动子构建的FCV HRB-SS株全长感染性cDNA克隆系统可直接在细胞内转录，减少了体外操作流程，有效防止了操作污染，具有操作简便，拯救效率高的优势，为后续FCV基因功能的研究和新型疫苗的研发奠定了基础。
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