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摘要
【目的】克隆小鼠Eif4A1基因，探讨真核翻译起始因子Eif4A1蛋白的结构和生物学特性。【方法】以小鼠脑总RNA为扩增模板，利用RT-PCR扩增获得小鼠Eif4A1基因的CDS区，构建原核表达载体pGEX-4T-Eif4A1-Flag和真核表达载体pcDNA3.0-Eif4A1-Flag；利用大肠杆菌表达系统对原核质粒进行诱导表达、纯化及鉴定；在HEK-293T细胞中转染真核表达载体，用免疫印迹技术和免疫荧光技术检测Eif4A1蛋白在HEK-293T细胞内表达及分布情况；利用多种生物学信息软件分析该蛋白的理化性质、信号肽及其结构特点。【结果】鼠源Eif4A1基因CDS区长1221 bp，编码407个氨基酸残基，通过原核诱导表达，Eif4A1蛋白主要以包涵体的形式存在，约72 kD。将真核表达载体pcDNA3.0-Eif4A1-Flag转染HEK-293T细胞，用免疫印迹技术检测到Eif4A1蛋白和FLAG标签蛋白，显示Eif4A1蛋白在HEK-293T中成功表达，通过间接免疫荧光证明该蛋白主要定位在HEK-293T细胞质中。生物信息学分析表明，Eif4A1蛋白理化性质不稳定，属亲水性蛋白，无跨膜结构域，不含有信号肽，α-螺旋是其主要的二级结构。【结论】作为真核细胞翻译起始的重要蛋白，通过原核表达载体和真核表达载体的构建和表达，可对其生物学功能和结构进行深入研究，特别是在体外和细胞内的表达系统中鉴定Eif4A1的互作蛋白，对其作用网络进行探索。
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