利用CRISPR/Cpf1技术构建HEK293细胞DDX21基因稳定敲除株及功能鉴定

作者：鲁国涛; 王辉; 曾为俊; 邵玉乐; 许曼; 陈洪岩; 孟庆文^*

来源：中国兽医学报, 2020, 40(02): 257-263.

DOI：10.16303/j.cnki.1005-4545.2020.02.07

• DDX21基因
• H9N2亚型禽流感病毒
• CRISPR/Cpf1
• HEK293细胞
• 基因敲除

利用CRISPR/Cpf1基因编辑技术构建DDX21基因稳定敲除的细胞株,并检测其生物学功能。设计、构建靶向DDX21基因向导RNA表达载体,与Cpf1表达载体共转染HEK293细胞,通过流式筛选、基因测序、Western blot和细胞增殖能力检测鉴定细胞株;荧光定量PCR检测病毒感染后模式识别受体(TLR-3、TLR-7、MDA-5)、Ⅰ型干扰素、IL-6以及抗病毒蛋白OAS mRNA水平表达情况。结果显示:成功筛选到2株DDX21基因敲除的细胞株,蛋白免疫印迹显示DDX21蛋白不表达;与野生型(wild type,WT)相比敲除株形成细胞单层的时间明显延长(P<0.01);H9N2亚型禽流感病毒感染试验表明,模式识别受体TLR-3、MDA-5的mRNA表达水平上调,TLR-7表达水平无明显差异,IFN-α、IFN-β、IL-6及抗病毒蛋白OAS的mRNA表达水平下调,表明DDX21基因敲除阻断了DDX21-TRIF-MyD88信号通路;TCID50测定结果显示,差异最高可达到WT的3.01倍,表明DDX21基因敲除后流感病毒复制增加。本研究利用CRISPR/Cpf1系统获得2株DDX21基因稳定敲除的HEK293细胞株,为深入研究DDX21基因功能、病毒感染的天然免疫应答和调控研究奠定理论基础。

• 单位
  兽医生物技术国家重点实验室; 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所