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摘要
目的 探索黄芪建中汤含药血清对异丙肾上腺素(ISO)诱导的3T3-L1脂肪细胞脂解及棕色化模型的抑制作用及与脑和肌肉芳烃受体核转录因子样蛋白-1(BMAL1)调控环磷酸腺苷(cAMP)/蛋白激酶A(PKA)/环磷酸腺苷反应成分结合蛋白(CREB)信号通路的关系。方法 制备空白及黄芪建中汤含药血清。体外培养3T3-L1脂肪细胞，诱导其分化成熟后分为对照组、空白组、2.5%含药血清组、5%含药血清组、10%含药血清组。除对照组外，其余各组加入10 mmol/L ISO以构建脂肪细胞过度脂解及棕色化模型。采用油红O染色法和酶联免疫吸附剂测定(ELISA)法检测各组脂肪细胞内脂滴阳性面积比及其水解后产物的含量，采用实时荧光PCR法和蛋白质印迹法检测各组脂肪细胞脂解及棕色化相关基因及蛋白的表达，以筛选出最优体积分数的含药血清进行下一步慢病毒转染实验。取分化成熟的3T3-L1脂肪细胞，分别加入BMAL1小干扰RNA、空载体小干扰RNA,构建沉默BMAL1的3T3-L1脂肪细胞。将细胞分为空载体组、含药血清空载体组、BMAL1沉默组和含药血清BMAL1沉默组。各组加入ISO孵育后，油红O染色法检测各组脂肪细胞内脂滴阳性面积比；ELISA法检测各组脂肪细胞内甘油三酯(TG)、cAMP及培养基中游离脂肪酸(FFA)的含量；蛋白质印迹法检测PKA、CREB的蛋白表达；实时荧光PCR法检测激素敏感性脂肪酶(HSL)、甘油三酯脂肪酶(ATGL)、线粒体解偶联蛋白1(UCP1)和T-box转录因子1(TBX1)的mRNA表达。结果 与2.5%及5%含药血清组比较，10%含药血清组细胞内cAMP含量及培养基中FFA含量降低(均P<0.05)、TG含量升高(P<0.05)、PKA蛋白表达降低(P<0.05)、HSL及ATGL mRNA表达降低(均P<0.05)。慢病毒转染3T3-L1脂肪细胞后，与空载体组比较，BMAL1沉默组中BMAL1蛋白表达降低(P<0.05),表明BMAL1沉默的脂肪细胞成功构建。与空载体组比较，BMAL1沉默组细胞内脂滴阳性面积比及TG含量降低(均P<0.05),培养基中FFA含量、细胞内cAMP含量和PKA、CREB蛋白表达升高(均P<0.05),HSL、ATGL、UCP1和TBX1 mRNA表达量升高(均P<0.05)。与BMAL1沉默组比较，含药血清BMAL1沉默组细胞内脂滴阳性面积比及TG含量升高(均P<0.05),培养基中FFA含量、细胞内cAMP含量、PKA和CREB蛋白表达降低(均P<0.05),HSL、ATGL、UCP1及TBX1的mRNA表达降低(均P<0.05)。结论 黄芪建中汤含药血清可以抑制ISO诱导的3T3-L1脂肪细胞脂解及棕色化，其机制可能通过介导BMAL1调控cAMP/PKA/CREB信号通路有关。
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单位山东中医药大学附属医院; 山东中医药大学; 第一临床医学院
