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摘要
目的构建LV5-h Cx32慢病毒表达载体,获得稳定高表达人缝隙连接蛋白32(connexin32,Cx32)的Huh7人肝癌细胞系,并研究Cx32对Huh7细胞增殖的影响。方法采用全基因合成法并经PCR扩增得到Cx32基因序列,将所得目的片段克隆到LV5-GFP载体上,获得重组慢病毒质粒LV5-GFP-h Cx32,经酶切鉴定及DNA测序鉴定后,与慢病毒包装质粒系统共转染293T细胞中,包装成重组慢病毒颗粒,经荧光显微镜测定重组慢病毒滴度。将慢病毒载体LV5-h Cx32和LV5-NC感染Huh7细胞,嘌呤霉素筛选出细胞阳性克隆并扩大培养。qRT-PCR、Western blot和免疫荧光法分析Cx32的表达及定位;细胞接种荧光示踪法检测细胞缝隙连接(gap junction,GJ)功能;MTT法及克隆形成实验观察细胞增殖能力的变化。结果双酶切及测序结果表明LV5-GFPh Cx32慢病毒载体构建成功,经293T细胞包装后,成功获得病毒滴度为3×1011TU·L-1的重组慢病毒LV5-GFP-h Cx32,慢病毒瞬时感染后的Huh7细胞中Cx32 mRNA和蛋白表达水平明显增多,筛选后建立的稳定转染细胞系中Cx32也稳定高表达,并且部分表达于细胞膜,形成有功能性的GJ。过表达Cx32的Huh7细胞增殖能力减弱(P<0.05)。结论成功构建Cx32基因过表达慢病毒载体,该载体能够稳定感染Huh7细胞,使外源基因Cx32过表达并抑制细胞的增殖能力。
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