缺口酶Cas9 D10A和Cas9 H840A在大肠杆菌基因组编辑中的应用

作者：韦佳妤; 吴方^*

来源：基因组学与应用生物学, 2022, 41(08): 1677-1691.

DOI：10.13417/j.gab.041.001677

• CRISPR/Cas9n
• 大肠杆菌
• 基因编辑
• sseA
• 缺口酶

目前Ⅱ型CRISPR/Cas9工具被广泛应用于基因组编辑中，利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术对大肠杆菌(Escherichia coli)基因组进行编辑，可应用于代谢工程及细菌耐药性等研究领域中。利用单缺口核酸酶Cas9 nickase (Cas9n)工具对宿主细胞基因进行修饰，可降低由于双链断裂对宿主带来的毒性。但目前利用CRISPR/Cas9n对大肠杆菌基因组编辑的研究较少，不利于缺口酶Cas9 D10A和Cas9 H840A在大肠杆菌基因组编辑的应用。本研究在前人报道的细菌双质粒Cas9基因编辑系统(pCas/pTarget)基础上，通过分子突变的方法构建缺口酶Cas9突变体质粒pCas-D10A和pCas-H840A,以及携带修复模板或无修复模板的靶向大肠杆菌sseA基因的质粒pTargetT-△sseA(993 bp)和pTargetT-△sseA,系统研究了两种缺口酶编辑大肠杆菌内源性基因sseA的有效性和效率。在稳定表达pCas质粒的MG1655菌株中转入携带修复模板的pTargetT-△sseA(993 bp)质粒，通过菌落PCR及DNA测序方法验证基因编辑的有效性和效率，同时用醋酸铅试纸生化方法对敲除sseA基因的菌株进行功能验证。同时，将不含修复模板的pTargetT-△sseA质粒转入含有pCas的MG1655菌株中，通过平板菌落计数检测编辑效率。实验结果表明，在有修复模板和无修复模板两种系统中，Cas9 D10A和Cas9 H840A均可以编辑大肠杆菌内源性基因sseA,两者编辑效率基本一致，但都低于Cas9-WT的编辑效率。相对于野生型Cas9、 Cas9 D10A或Cas9 H840A编辑大肠杆菌基因组时具有更小的细菌毒性。本研究为后续发展大肠杆菌的基因组编辑技术提供了一定的研究基础和新的研究思路。

• 单位
  上海交通大学