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摘要
目的:基于AMPK/PPARα信号通路探讨知柏地黄汤含药血清干预UU感染的大鼠生精细胞能量代谢的影响及其作用机制。方法:采用在体UU感染建模,随后原代提取大鼠生精细胞,采用生精细胞与支持细胞共培养的方式,进行生精细胞体外培养,以知柏地黄汤含药血清(高、中、低剂量组)为试验施加因素,同时设正常组、西药组和模型组。各组给予相应的含药血清或空白血清干预,在连续倒置显微镜下观察细胞培养过程中的生长状态和形态变化,采用比色法检测细胞上清液中LDH含量及细胞相对葡萄糖摄取量,采用流式细胞术检测生精细胞凋亡、电镜观察生精细胞超微结构、Western印迹检测生精细胞中AMPK和PPARα的蛋白表达。结果:正常组、模型组、西药组、知柏地黄汤(高、中、低剂量组)生精细胞LDH的含量分别为(60.72±1.83)、(201.12±2.88)、(90.66±1.61)、(94.74±1.20)、(101.24±2.03)、(111.04±3.35) mU/ml; UU感染后生精细胞上清液中LDH含量明显,增多较之正常生精细胞差异显著(P<0.01),不同浓度的知柏地黄汤含药血清可不同程度降低生精细胞LDH的分泌。正常组、模型组、西药组、知柏地黄汤(高、中、低剂量组)生精细胞凋亡率分别为(10.09±0.52)%、(49.24±0.86)%、(11.21±1.02)%、(30.64±0.99)%、(35.54±1.17)%、(42.95±1.31)%;UU感染可诱导生精细胞的凋亡,凋亡率较之正常生精细胞明显升高(P<0.01),不同浓度的知柏地黄汤含药血清可不同程度抑制UU感染的生精细胞凋亡。正常组、模型组、西药组、知柏地黄汤(高、中、低剂量组)生精细胞葡萄糖摄取率依次为(99.86±1.26)%、(49.42±1.70)%、(86.90±2.03)%、(84.14±1.21)%、(80.30±1.37)%、(75.18±1.76)%;UU感染后生精细胞葡萄糖摄取率减少,较之正常生精细胞差异显著(P<0.01),不同浓度的知柏地黄汤含药血清可不同程度修复生精细胞葡萄糖摄取。正常组、模型组、西药组、知柏地黄汤(高、中、低剂量组)生精细胞ATP的含量依次为(58.94±1.95)、(19.76±1.46)、(48.34±1.34)、(42.82±1.30)、(38.70±2.03)、(34.78±0.82)μmol/L;UU感染后生精细胞内ATP含量明显减少,较之正常生精细胞差异显著(P<0.01),不同浓度的知柏地黄汤含药血清可不同程度上调生精细胞ATP的含量。UU感染的模型组生精细胞线粒体大小不一,结构不完整,排列紊乱,部分发生肿胀变形,线粒体嵴溶解断裂甚者断裂,不同浓度的知柏地黄汤含药血清可不同程度抑制UU感染的生精细胞线粒体损伤。正常组、模型组、西药组、知柏地黄汤(高、中、低剂量组)生精细胞线粒体膜电位依次为(2.43±0.25)%、(8.53±0.71)%、(3.92±0.36)%、(4.43±0.27)%、(4.65±0.22)%、(4.88±0.10)%;UU感染后生精细胞线粒体功能受损,线粒体膜电位升高,较之正常生精细胞差异显著(P<0.01),不同浓度的知柏地黄汤含药血清可不同程度促使线粒体膜电位去极化,趋于稳定,线粒体膜电位不同程度下降。UU感染后生精细胞AMPK和PPARα蛋白磷酸化水平升高,较之正常生精细胞差异显著(P<0.01),不同浓度的知柏地黄汤含药血清可不同程度下调AMPK和PPARα蛋白磷酸化水平,存在一定程度的量效关系。结论:知柏地黄汤可能通过平衡AMPK和PPARα信号通路的磷酸化水平,提高葡萄糖摂取率,上调ATP含量,改善线粒体结构的破坏,最终抑制UU感染引起的生精细胞的凋亡和LDH的分泌,进一步从细胞和分子水平为知柏地黄汤治疗UU感染性不育(弱精子症)的作用机制提供实验依据。
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单位湖南中医药大学第一附属医院; 湖南中医药大学; 湖南东健药业有限公司
