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摘要
目的 探讨异体糖尿病大鼠来源脂肪干细胞(ASC)是否对糖尿病大鼠创面有促愈作用及其机制。方法 (1)取56只12～16周龄雄性Wistar大鼠,按随机数字表法(分组方法下同)分为糖尿病组和健康组,每组28只。健康组大鼠不进行任何处理；糖尿病组大鼠于腹腔一次性注射10 g/L链脲佐菌素60 mg/kg,建立糖尿病模型。按随机数字表法取健康组和糖尿病组大鼠各4只,取腹股沟处脂肪组织,培养纯化ASC以获得健康大鼠来源ASC(下称nASC)和糖尿病大鼠来源ASC(下称dASC)。取第3代nASC和dASC(样本数均为3),流式细胞仪检测细胞表面分化抗原CD105、CD31、CD34及CD44的阳性表达率,确定纯度。(2)取健康组和糖尿病组剩余大鼠各24只,每只大鼠背部制作3个直径12 mm的圆形全层皮肤缺损创面。伤后即刻,分别于每只大鼠3个创面及其创缘皮下注射磷酸盐缓冲液(PBS)、2×107个/mL的nASC、2×107个/mL的dASC各0.5 mL。伤后1、3、7、12 d,按随机数字表法每组各取6只大鼠计算创面面积；取创面组织行苏木精－伊红染色,观察创面组织学形态。(3)对人ASC(hASC)进行传代培养,采用第4～7代细胞进行后续实验。将hASC分为7组,每组12个样本。空白对照组细胞用间充质干细胞培养液培养,单纯晚期糖基化终末产物(AGE)组、单纯蛋白组、单纯高糖组、单纯高渗透压组、AGE高糖联合组、蛋白高渗透压联合组细胞分别用加入终质量浓度100 mg/L AGE、100 mg/L牛血清白蛋白(BSA)、28 mmol/L D－葡萄糖、28 mmol/L甘露醇、100 mg/L AGE＋28 mmol/L D－葡萄糖、100 mg/L BSA＋28 mmol/L甘露醇的间充质干细胞培养液培养。培养2 h及2、4、6 d,采用细胞计数试剂盒8法检测细胞增殖情况。(4)取hASC,分为空白对照组、单纯AGE组、单纯高糖组、AGE高糖联合组,每组12个样本,同实验(3)相应组处理。培养0、2、4、6 d,流式细胞仪检测细胞表面分化抗原CD105、CD44、CD45阳性表达率以确定其稳态。(5)取hASC,分为AGE高糖联合组和蛋白高渗透压联合组,每组9个样本,同实验(3)相应组处理。培养2、4、6 d,采用花青素3－链霉亲和素双抗体夹心技术检测细胞内蛋白表达水平。对数据进行析因设计方差分析、LSD检验及Bonferroni校正。结果 (1)nASC、dASC的CD44阳性表达率均>96%,CD31、CD34阳性表达率低,CD105阳性表达率为40%左右,基本符合纯度要求。(2)2组大鼠组内3种方式处理创面伤后1 d面积均相近(P>0.05)。与组内PBS处理创面的(0.682 1±0.078 9)、(0.314 3±0.113 7)、(0.064 3±0.002 1)cm2比较,健康组大鼠nASC处理创面面积于伤后3、7、12 d显著缩小[(0.464 1±0.092 6)、(0.223 9±0.072 7)、(0.034 3±0.012 5)cm2,P<0.05]；健康组大鼠dASC处理创面面积于伤后3、12 d显著缩小[(0.514 1±0.124 1)、(0.043 7±0.032 8 )cm2,P<0.05],伤后7 d无明显改变[(0.274 2±0.062 5)cm2,P>0.05]。与组内dASC处理创面比较,健康组大鼠nASC处理创面面积于伤后3、7 d显著缩小(P<0.05),伤后12 d无明显改变(P>0.05)。与组内PBS处理创面的(0.853 5±0.204 8)、(0.670 5±0.164 8)、(0.131 4±0.074 4)cm2比较,糖尿病组大鼠nASC处理创面面积于伤后3、7、12 d显著缩小[(0.633 4±0.132 5)、(0.331 8±0.023 5)、(0.074 2±0.003 8)cm2,P<0.05]；糖尿病组大鼠dASC处理创面面积于伤后3 d显著缩小[(0.773 6±0.182 2)cm2,P<0.05],伤后7、12 d无明显改变[(0.510 6±0.192 2)、(0.114 4±0.003 1)cm2,P>0.05]。与组内dASC处理创面比较,糖尿病组大鼠nASC处理创面面积伤后3、7 d无明显改变(P>0.05),伤后12 d显著缩小(P<0.05)。伤后1 d各组大鼠组内3种方式处理创面组织学形态无明显差异。伤后3 d,2组大鼠nASC、dASC处理创面都有少量微血管形成,PBS处理创面几乎未见微血管形成。伤后7 d,2组大鼠nASC、dASC处理创面内可见较多小血管及成纤维细胞(Fb),PBS处理创面小血管及Fb略少。伤后12 d,2组大鼠nASC、dASC处理创面已基本被上皮组织覆盖；健康组大鼠PBS处理创面内肉芽组织不明显,糖尿病组大鼠PBS处理创面未全部上皮化。(3)与空白对照组比较,单纯AGE组hASC细胞量于培养2、4、6 d显著减少(P<0.05),单纯高糖组hASC细胞量于培养2、4 d显著增加(P<0.05),AGE高糖联合组hASC细胞量于培养4、6 d时显著减少(P<0.05)。(4)与组内培养4 d比较,空白对照组、单纯AGE组、AGE高糖联合组hASC培养6 d时CD105阳性表达率明显下降(P<0.05)。各组hASC各时间点CD44阳性表达率均>95%,CD45阳性表达率均<2%。(5)共有7种蛋白检测值位于可信区间。2组hASC中碱性成纤维细胞生长因子、基质金属蛋白酶组织抑制剂1表达水平均随培养时间延长呈上升趋势。AGE高糖联合组hASC中人单核细胞趋化蛋白1(MCP－1)表达水平随培养时间的延长呈上升趋势,生长相关性癌基因(GRO)表达水平则在培养6 d时显著高于组内培养4 d时(P<0.05)；蛋白高渗透压联合组hASC中MCP－1、GRO表达水平均随培养时间延长呈下降趋势。蛋白高渗透压联合组hASC中卵泡抑素表达水平在培养4 d时明显下降,AGE高糖联合组hASC中卵泡抑素表达水平则在培养6 d时显著低于组内培养4 d时(P<0.05)。蛋白高渗透压联合组hASC中血管内皮生长因子(VEGF)表达水平随培养时间延长逐渐下降,AGE高糖联合组hASC中VEGF表达水平在培养4 d时较组内培养2 d时显著下降(P<0.05)。蛋白高渗透压联合组hASC中尿激酶型纤溶酶原激活剂受体表达水平在培养6 d时较组内培养4 d时显著升高(P<0.05),且显著高于AGE高糖联合组培养6 d时(P<0.05)。结论 nASC和dASC对大鼠单纯缺损伤创面都有促愈作用,但dASC对合并糖尿病大鼠创面的促愈作用不显著,这可能与高糖及AGE干预可抑制ASC增殖并影响其稳态及分泌功能有关。
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