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摘要
目的探讨阿帕替尼对食管癌细胞生物学功能、食管癌裸鼠移植瘤生长情况的影响及其机制。方法采用2.5、5、10、20、40 μmol/L阿帕替尼处理食管癌细胞KYSE-150和ECA-109, 采用四甲基偶氮唑蓝法检测食管癌细胞的增殖活性, 采用Transwell小室法检测食管癌细胞的迁移能力, 采用克隆形成法检测食管癌细胞的克隆形成率, 采用流式细胞术检测阿帕替尼对细胞周期和细胞凋亡的影响, 采用实时荧光定量PCR法检测食管癌细胞中血管内皮细胞生长因子(VEGF) mRNA和VEGF受体2(VEGFR-2) mRNA的表达, 采用酶联免疫吸附法检测食管癌细胞上清液中VEGF浓度, 采用Western blot法检测正常培养条件下和VEGF刺激下食管癌细胞中MEK、ERK、磷酸化MEK(p-MEK)、磷酸化ERK(p-ERK)、JAK2、STAT3和磷酸化STAT3(p-STAT3)的表达。建立人食管鳞癌裸鼠移植瘤模型, 采用随机数字表法随机分为健康对照组、250 mg阿帕替尼组和500 mg阿帕替尼组, 计算肿瘤抑制率, 采用免疫组化法检测移植瘤瘤组织中VEGF和VEGFR-2的表达。结果 20、40 μmol/L阿帕替尼处理细胞24 h后, KYSE-150细胞的迁移数分别为(428.67±4.16)个和(286.67±1.53)个, ECA-109细胞的迁移数分别为(1 123.67±70.00)个和(477.33±26.84)个, 均低于空白对照组[分别为(874.67±22.75)个和(1 749.67±65.77)个], 差异均有统计学意义(均P<0.05)。10、20、40 μmol/L阿帕替尼处理细胞7 d后, KYSE-150细胞的克隆形成率分别为(65.12±25.48)%、(58.19±24.73)%和(29.10±22.40)%, ECA-109细胞的克隆形成率分别为(70.61±15.14)%、(61.12±17.21)%和(43.09±11.13)%, 均低于空白对照组(100%), 差异均有统计学意义(均P<0.05)。KYSE-150细胞中, 20 μmol/L阿帕替尼组的G2/M期细胞比例和凋亡率分别为(26.27±3.30)%和(15.65±1.54)%, 空白对照组分别为(12.14±2.13)%和(3.49±0.74)%, 差异均有统计学意义(均P<0.05)。ECA-109细胞中, 20 μmol/L阿帕替尼组细胞的G2/M期细胞比例和凋亡率分别为(22.64±2.36)%和(49.26±1.62)%, 空白对照组分别为(3.44±0.57)%和(6.31±1.43)%, 差异均有统计学意义(均P<0.05)。20、40 μmol/L阿帕替尼抑制后, KYSE-150细胞中VEGF mRNA的相对表达水平分别为42.57±10.43和25.69±1.24;VEGFR-2 mRNA的相对表达水平分别为36.09±10.82和13.99±6.54, 均低于空白对照组(100.00±0.00), 差异均有统计学意义(均P<0.05)。20、40 μmol/L阿帕替尼抑制后, ECA-109细胞中VEGF mRNA的相对表达水平分别为75.68±9.37和20.11±3.45;VEGFR-2 mRNA的相对表达水平分别为17.24±9.52和7.77±3.89, 均低于空白对照组(100.00±0.00), 差异均有统计学意义(均P<0.05)。20、40 μmol/L阿帕替尼处理后, KYSE-150细胞中VEGF的浓度分别为(766.48±114.27)pg/ml和(497.40±102.18)pg/ml, 均低于空白对照组[(967.41±57.75)pg/ml], 差异均有统计学意义(均P<0.05);20、40 μmol/L阿帕替尼处理后, ECA-109细胞中VEGF的浓度分别为(675.21±46.69)pg/ml和(598.95±47.60)pg/ml, 均低于空白对照组[(980.68±92.74) pg/ml], 差异均有统计学意义(均P<0.05)。40 μmol/L阿帕替尼作用72 h后, KYSE-150细胞中p-MEK和p-ERK的相对表达水平分别为0.49±0.05和0.28±0.03, 均低于空白对照组(分别为1.23±0.19和0.66±0.07), 差异均有统计学意义(均P<0.05);40 μmol/L阿帕替尼处理后, ECA-109细胞中p-MEK和p-ERK的相对表达水平分别为0.63±0.03和1.22±0.15, 均低于空白对照组(分别为1.03±0.20和1.76±0.20), 差异均有统计学意义(均P<0.05)。20 μmol/L阿帕替尼处理后, KYSE-150细胞中STAT3和p-STAT3蛋白的相对表达水平分别为0.62±0.09和0.36±0.13, 空白对照组分别为0.96±0.15和0.85±0.16, 差异均有统计学意义(均P<0.05)。250 mg阿帕替尼组和500 mg阿帕替尼组食管癌荷瘤裸鼠的抑瘤率分别为29.25%和19.96%, 健康对照组、250 mg阿帕替尼组和500 mg阿帕替尼组裸鼠移植瘤组织中VEGF的浓度分别为(25.11±4.12)pg/ml、(16.40±2.81)pg/ml和(15.04±4.88)pg/ml, 差异无统计学意义(P>0.05)。结论阿帕替尼可诱导食管癌细胞KYSE-150和ECA-109的凋亡而抑制其增殖、迁移和克隆形成, 并抑制食管癌裸鼠移植瘤生长, 其机制可能与VEGF相关通路Ras/Raf/MEK/ERK和JAK2/STAT3密切相关。
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单位常州市第二人民医院; 南京医科大学; 上海交通大学医学院附属瑞金医院
