猪CD163基因的单碱基编辑研究

作者：赵为民; 王慧利; 曹少先; 郭日红; 王泽平; 陈哲; 徐奎; 付言峰; 李碧侠; 任守文; 程金花^*

来源：畜牧兽医学报, 2022, 53(04): 1041-1050.

• CRISPR/Cas9
• 单碱基编辑
• CD163基因
• 猪

旨在利用YE1-BE3-FNLS载体对猪的CD163基因进行C>T的单碱基突变，形成终止密码子TAA,从而导致CD163基因翻译的提前终止。利用网站在猪CD163基因的第7外显子筛选到高效率的sgRNA序列使其符合C5位点，并且C5后续的两个碱基为AA,CAA与起始密码子ATG之间的碱基数为3的整数倍。PCR扩增CD163-sgRNA和YE1-BE3-FNLS载体中的APOBEC-Cas9n-UGI片段，通过体外转录形成CD163-sgRNA和APOBEC-Cas9n-UGI mRNA。体外培养猪卵母细胞并进行孤雌激活，利用显微操作仪对孤雌胚胎进行CD163-sgRNA和APOBEC-Cas9n-UGI mRNA注射，待胚胎发育至桑椹胚和囊胚阶段，提取胚胎基因组DNA对单碱基编辑区域进行PCR扩增测序。结果显示，在49个候选sgRNA中成功筛选出一个CD163-sgRNA,利用PCR成功扩增了CD163-sgRNA和APOBEC-Cas9n-UGI片段，注射CD163-sgRNA和APOBEC-Cas9n-UGI mRNA后的猪孤雌胚胎发育到2～4细胞期。挑选注射的20个2～4细胞期胚胎经过PCR扩增与产物测序后发现有12个胚胎的CD163基因的第7外显子的预期位点C(num1479)>T,单碱基编辑效率约60%。对CD163-sgRNA的off-target分析发现，在错配3个碱基的情况下该CD163-sgRNA有5个off-target区域，对这5个区域进行PCR扩增和sanger测序分析后发现都没有发生C>T的突变。本研究利用YE1-BE3-FNLS工具在胚胎水平上对猪的CD163基因进行了单碱基编辑，成功使得该基因第7外显子预期位点(num1479)C变为T,从而使得密码子CAA变为TAA,可提前终止CD163基因的翻译。

• 单位
  中国农业科学院深圳农业基因组研究所; 江苏省农业科学院