巢蛋白的克隆、表达、抗体制备及免疫组化分析

作者：陈新林; 刘勇; 肖新莉; 张瑾; 吕海侠; 张蓬勃; 刘建新; 赵建军

来源：南方医科大学学报, 2006, 26(02): 196-200.

DOI：10.3321/j.issn:1673-4254.2006.02.013

• 巢蛋白
• 分子克隆
• 原核表达
• 抗体
• 免疫组织化学

目的在原核系统中克隆、表达并纯化巢蛋白(nestin),制备特异性nestin抗体,用于研究nestin在中枢神经系统发育中的生物学特性,探索神经发育及再生规律。方法采用RT-PCR方法由人神经干细胞中获取nestin cDNA,与原核表达载体pQE30连接,构建重组载体pQE30-nestin。测序后,将重组质粒转入大肠杆菌M15,IPTG诱导表达His融合蛋白。Ni-NTA亲和层析柱纯化后,SDS-PAGE电泳和Western blotting鉴定。用此蛋白免疫BALB／c小鼠,获得抗血清。 Western blotting、ELISA和免疫组织化学分析鉴定获取的抗血清。结果成功由人神经干细胞中克隆nestin cDNA片段。 IPTG诱导重组质粒pQE30-nestin表达出一相对分子质量约25 000的His融合蛋白并被Ni-NTA成功纯化,Western blotting证明其确为nestin蛋白。动物免疫后,经Western blotting、ELISA和免疫组化鉴定,获得的抗血清可特异性结合重组nestin蛋白、发育期人及大鼠脑内的nestm蛋白。结论获得了重组人nestin蛋白,制备的抗血清不仅可识别重组 nestin蛋白,亦可识别人及大鼠脑组织内的nestin蛋白。

• 单位
  西安交通大学; 西安交通大学医学院第二附属医院