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摘要
【目的】制备家蚕Bombyx mori抗真菌因子BmSPI39的多克隆抗体,分析BmSPI39对球孢白僵菌Beauveria bassiana入侵的表达响应。【方法】利用原核表达和固定化镍离子亲和层析技术获得高纯度的BmSPI39重组蛋白,利用胶内活性染色检测重组蛋白BmSPI39对枯草杆菌Bacillus subtilis蛋白酶A的抑制活性;利用重组蛋白BmSPI39,通过免疫新西兰大白兔制备BmSPI39的多克隆抗体。基于家蚕开放性数据库SilkDB 3.0,分析BmSPI39在4龄第3天至化蛹后1 d家蚕免疫相关组织体壁、中肠和脂肪体中的时空表达特征。利用制备的BmSPI39抗体通过Western blot分析感染球孢白僵菌不同时间后家蚕幼虫和蛹体壁中BmSPI39应答球孢白僵菌入侵的表达响应。【结果】胶内活性染色结果显示,重组BmSPI39蛋白能够强烈抑制枯草杆菌蛋白酶A的活性。酶联免疫吸附结果显示,BmSPI39抗血清的抗体效价达1∶128 000。Western blot和胶内活性染色结果显示,纯化后的BmSPI39抗体能够有效结合不同多聚体化状态下的BmSPI39抗原蛋白。BmSPI39表达数据的热图分析显示,BmSPI39在游走期和预蛹期的家蚕体壁中有表达,在预蛹期的脂肪体中的表达量较高,但在各发育阶段的中肠中均不表达。Western blot分析结果表明,家蚕幼虫体壁中的BmSPI39的表达在感染球孢白僵菌后84 h上调表达,108和120 h下调表达。【结论】本研究成功制备了BmSPI39的多克隆抗体。BmSPI39蛋白的表达能够响应球孢白僵菌入侵,可能参与蛹期家蚕抵御真菌入侵的过程。
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