三孢布拉霉crgA启动子的克隆和活性分析

作者：桂仁跃; 洪宇; 余晓斌; 罗玮^*

来源：微生物学通报, 2023, 50(12): 5275-5285.

DOI：10.13344/j.microbiol.china.230388

• 三孢布拉霉
• crgA
• 启动子活性
• 农杆菌
• β-D-葡萄糖苷酸酶
• 光调控

【背景】CrgA是三孢布拉霉(Blakesleatrispora,Bt)中调控类胡萝卜素合成的关键负调控因子，其表达水平会影响类胡萝卜素的合成。【目的】克隆三孢布拉霉crgA启动子并分析其活性，为进一步解析CrgA表达调控机制奠定基础。【方法】通过综合微生物基因组(integrated microbial genomes, IMG)数据库提供的基因组序列，克隆crgA翻译起始位点上游2 000 bp序列，分析其顺式调控元件和转录起始区域预测，通过RT-qPCR分析不同光照时间对三孢布拉霉crgA相对转录水平的影响；构建4个不同长度的crgA启动子截短序列驱动的GUS-mGFP5重组表达载体p1303-procrgAF、F1、F2和F3，利用农杆菌侵染整合到三孢布拉霉基因组中，在黑暗和光照条件下测定β-D-葡萄糖苷酸酶(β-D-glucuronidase,GUS)酶活性并观察荧光信号。【结果】crgA启动子不仅包含基础的TATA-box和CAAT-box元件，还包括多个与光响应相关的元件。观察荧光结果显示CaMV35S和构建的4个突变启动子均能在三孢布拉霉体内驱动下游基因表达，检测GUS酶活性发现procrgAF3活性最强，且截短的启动子活性均强于CaMV35S,btcrgA启动子序列在1 499-989 bp范围内有激活下游基因表达的光响应元件。【结论】三孢布拉霉的crgA表达具有“光激活”和“光适应”现象，crgA启动子核心区位于procrgAF3序列，btcrgA启动子上具有响应光调控的顺式作用元件位于1 499-989 bp。

• 单位
  生物工程学院; 江南大学