氟咯草酮通过IRE1α-JNK信号通路介导小鼠睾丸组织细胞及TM4细胞凋亡

作者：张芬; 李睿; 赵淑琦; 王彦娜; 倪志晶; 常秀丽; 周志俊^*

来源：环境与职业医学, 2022, 39(09): 996-1003.

• 氟咯草酮
• 睾丸组织
• TM4细胞
• 凋亡
• 内质网应激
• 未折叠蛋白反应

[背景]氟咯草酮(FLC)可诱导睾丸支持细胞凋亡，但其具体机制尚未阐明。[目的]通过体内动物及体外细胞系构建FLC染毒模型，探究FLC染毒后小鼠睾丸组织中细胞凋亡以及小鼠睾丸支持细胞系TM4细胞凋亡和内质网应激活化情况，并通过干预实验探究肌醇需酶1α(IRE1α)-c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路在FLC诱导TM4细胞凋亡过程中的作用。[方法]利用C57BL/6雄性小鼠28 d经口染毒3、15、75和375 mg·(kg·d)-1 FLC结束后留取的睾丸标本，通过TUNEL染色观察睾丸组织中细胞凋亡发生情况，通过Western blotting检测睾丸组织中的凋亡蛋白[B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相互作用介质(Bim)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)]表达水平。在体外细胞实验中，使用不同浓度(40、80和160μmol·L-1)的FLC对TM4细胞染毒6 h，采用流式细胞术检测细胞凋亡率，Western blotting检测凋亡蛋白(Bcl-2、Bim、Bax)及内质网应激相关蛋白[葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、磷酸化-蛋白激酶R样内质网激酶(p-PERK)、活化转录因子6(ATF6)、磷酸化-肌醇需酶1α(p-IRE1α)、磷酸化-JNK(p-JNK)]水平。随后使用IRE1α磷酸化抑制剂4μ8C(25、50μmol·L-1)、JNK磷酸化抑制剂SP600125(10、20μmol·L-1)预处理TM4细胞6 h后再使用160μmol·L-1 FLC染毒6 h，采用Western blotting检测凋亡及内质网应激相关蛋白水平，通过CCK-8法检测细胞活力。[结果]雄性C57BL/6小鼠经口染毒FLC 28 d后，睾丸组织TUNEL染色结果显示生精小管间质及基底部有细胞凋亡发生。Bcl-2家族抗凋亡蛋白Bcl-2水平在FLC染毒75、375 mg·(kg·d)-1组中较对照组下降(P<0.05)；而促凋亡蛋白Bim水平在FLC染毒75 mg·(kg·d)-1组中，Bax水平在FLC染毒375 mg·(kg·d)-1组中较对照组上升(P<0.05)。0、40、80和160μmol·L-1 FLC染毒组的细胞凋亡率分别为2.7%±0.2%、4.8%±1.3%、9.4%±0.3%、13.2%±0.2%,FLC染毒组细胞凋亡率均明显上升(P<0.05)。TM4细胞中Bcl-2蛋白水平在160μmol·L-1 FLC染毒时下降(P<0.05)，而Bim和Bax蛋白水平在80、160μmol·L-1 FLC染毒时均上升(P<0.05)，内质网应激相关蛋白(GRP78、p-PERK、ATF6、p-IRE1α和p-JNK)水平在FLC染毒后均上升(P<0.05)或呈上升趋势。4μ8C(25、50μmol·L-1)和SP600125(10、20μmol·L-1)预处理后，由FLC染毒引起的GRP78、p-IRE1α、p-JNK以及Bim、Bax蛋白表达水平上调幅度降低(P<0.05)或呈降低的趋势；预先使用两种抑制剂处理细胞后，FLC对细胞活力的损伤得到明显缓解(P<0.05)或呈缓解的趋势。[结论] FLC能够诱导小鼠睾丸组织发生细胞凋亡，并且通过激活内质网应激及IRE1α-JNK信号通路诱导TM4细胞凋亡发生。