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摘要
目的使用新的方法直接从少量粪便样品中分离和纯化隐孢子虫卵囊,并进行全基因组扩增(whole genome amplification,WGA),从而获得符合全基因组测序要求的隐孢子虫DNA。方法 10份新鲜牛源隐孢子虫粪便样品,用蔗糖和氯化铯离心法分离卵囊,然后使用免疫磁珠试剂盒纯化;用漂白水进行卵囊表面消毒,以除去细菌及真菌等病原微生物。采用QIAamp DAN Mini kit试剂盒提取基因组DNA,然后采用REPLI-g MIDI kit试剂盒进行WGA,最后,采用定量PCR对基因组DNA进行量和纯度检测。结果分离纯化后的卵囊计数为2.81×104个/g2.90×107个/g。提取基因组DNA后进行WGA,所有扩增产物均为大分子片段,表明WGA成功。WGA产物的DNA浓度为55.3ng/μl357.5ng/μl。隐孢子虫SSU rRNA基因的定量PCR扩增显示,10份样品纯化WGA产物的CT值范围为9.7517.76,其中有7个样品CT<15,满足全基因组测序要求。结论直接从粪便中分离和纯化隐孢子虫卵囊再进行WGA,可使隐孢子虫的基因组DNA浓度和纯度能达到测序要求,该方法使隐孢子虫全基因测序常规化是可行的。
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单位哈尔滨医科大学; 道里区人民医院
