H7亚型禽流感病毒HA蛋白在Sf9昆虫细胞中的表达纯化

作者：刘郁夫; 郝文茜; 冯美莹; 欧阳征亮; 陈瑞爱^*

来源：广东农业科学, 2023, 1-11.

• H7亚型
• 禽流感病毒
• HA
• 昆虫细胞
• 杆状病毒
• 表达纯化

【目的】为表达H7亚型禽流感病毒(avian influenza virus， AIV)HA蛋白。【方法】首先根据草地贪夜蛾昆虫细胞(Spodoptera frugiperda clone 9， Sf9)的密码子偏嗜性，优化并合成H7亚型AIV的HA序列，将其克隆至穿梭质粒pFastBac1中；接着将重组HA基因的杆状病毒质粒转染至Sf9昆虫细胞中，通过间接免疫荧光和western blots试验鉴定重组病毒是否拯救成功；再通过SYBR green染料法荧光定量PCR试验，建立基于gp64基因的杆状病毒qPCR定量方法，筛选出在Sf9细胞中表达HA重组蛋白的最佳感染复数和孵育时间；最后通过His镍株亲和纯化HA重组蛋白。【结果】表达H7亚型AIV HA蛋白的重组杆状病毒在Sf9细胞盲传3代之后，Sf9细胞开始出现细胞肿胀、脱落、死亡等细胞病变，表明重组杆状病毒拯救成功；通过间接免疫荧光和western blots试验发现，Sf9细胞内可出现与HA重组蛋白特异性结合的绿色荧光信号，特异性结合的HA重组蛋白条带大小约70 ku左右，与预期相符，并且HA重组蛋白可与H7亚型AIV阳性血清反应，表明HA重组蛋白表达成功；以构建的pUC19-gp64质粒为标准，建立基于gp64基因的杆状病毒qPCR检测方法，该方法在1×103～1×108 copy/μL间呈现良好的线性关系，标准曲线的相关系数R2=0.993；利用qPCR检测方法对杆状病毒液滴度进行定量，并通过western blots试验筛选HA蛋白表达的最佳感染复数和孵育时间，结果显示以10 MOI的比例接种Sf9细胞，孵育72 h，蛋白表达效果最好；通过His镍株亲和纯化HA重组蛋白，蛋白浓度为0.268 mg/mL，鸡红细胞凝集效价为4 log2。【结论】本试验在Sf9昆虫细胞中成功表达并纯化H7亚型AIV HA蛋白，并建立与之相应的杆状病毒荧光定量PCR检测方法，可为进一步评价H7亚单位疫苗的免疫原性提供前期基础。

• 单位
  肇庆大华农生物药品有限公司; 生命科学学院; 肇庆学院