10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-10-β-O-乙酰转移酶迭代饱和突变与活性位点分析

作者：张育楠; 陈天娇; 朱平^*

来源：中国医药生物技术, 2018, 13(06): 481-487.

• 10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-10-β-O-乙酰转移酶
• 迭代饱和突变
• 高活性突变体
• 丙氨酸扫描
• 潜在活性位点

目的利用迭代饱和突变技术进一步提高10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-10-β-O-乙酰转移酶双突变体DBATG38R/F301V的活性;通过丙氨酸扫描确定DBAT活性中心的重要位点。方法利用迭代饱和突变技术在现有双突变体DBATG38R/F301V的基础上对Ser396进行半饱和突变,筛选对10-去乙酰紫杉醇(DT)催化活性提高的突变体;对获得的高活性突变体蛋白进行催化DT的最适温度和最适pH测定;在最适pH条件下,将其分别用最适反应温度和0℃温育6 h,考察该蛋白的热稳定性;采用生物信息学方法分析活性提高的分子机制。对DBAT底物结合区域尚未进行分析的几个氨基酸进行丙氨酸扫描研究,分析这些位点在DBAT催化10-DAB和DT过程中的作用。结果获得了三突变体DBATG38R/F301V/S396I,其催化DT的活性为DBATG38R/F301V的1.6倍,该蛋白催化DT的最适条件为37.5℃,pH 7.5;该蛋白在37.5℃静置6 h后催化DT的活力为初始值的30%,在0℃静置6 h后为初始值的70%;丙氨酸扫描结果显示,Asn45在DBAT催化10-DAB和DT时都非常重要,而Asn42、Glu350、Glu355和Lys389位点对催化10-DAB的影响更大。结论将活性口袋内的亲水性氨基酸向疏水性氨基酸突变可能有利于DBAT对DT的催化,但氨基酸侧链的长度和空间构型也是影响催化活性的重要因素;发现Asn45可能是一个潜在的DBAT催化或底物结合位点。

• 单位
  天然药物活性物质与功能国家重点实验室; 中国医学科学院北京协和医学院; 药物研究所