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摘要
目的 采用簇状规则间隔短回文重复序列（CRISPR）/Cas9基因编辑技术构建质粒并敲除HEK-293细胞的HIF-1α基因。方法 通过在线软件设计3号外显子上靶向HIF-1α的sgRNA，并将其构建到CRISPR/Cas9载体中。经Sanger测序验证质粒构建正确后，将重组质粒通过Lipofectamine 3000转染到HEK-293细胞中。通过药物筛选提取细胞DNA和蛋白，用T7E1酶和Western blotting检测基因变化和蛋白表达情况。结果 Sanger测序结果显示，所设计的sgRNA成功插入到CRISPR/Cas9载体中，序列验证正确，重组质粒构建成功。T7E1酶切实验成功切除3条带，sgRNA的打靶效率为33.8%。Western blotting结果显示，经过氯化钴诱导、转染药筛后的HEK-293细胞蛋白表达水平较野生型细胞明显下降，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 成功构建靶向HIF-1α基因的CRISPR/Cas9载体，载体靶向敲除HIF-1α基因功能验证成功。
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