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摘要
目的 探讨丙戊酸钠（sodium valproic acid,VPA）对羰基氰化物间氯苯腙（carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone,CCCP）诱导的成骨细胞氧化应激损伤的保护作用及其机制。方法 新生SD大鼠10只，取颅骨采用组织块法分离培养成骨细胞并传代，对第1代细胞行ALP和茜素红染色鉴定。取第3代成骨细胞以2～18μmol/L CCCP分别培养2～18 min，细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK-8)检测细胞成活率，并基于半抑制浓度原理选择合适浓度及培养时间用于制备成骨细胞氧化应激损伤模型；采用0～2.0 mmol/mL VPA培养12～72 h后，CCK-8检测细胞活性，选择合适浓度进行下一步处理。将第3代细胞随机分为4组，包括空白对照组（正常培养细胞）、CCCP组（参照选择的浓度及培养时间行CCCP处理）、VPA+CCCP组（参照选择的浓度及培养时间行VPA预处理+CCCP处理）、VPA+CCCP+ML385组（VPA预处理前用10μmol/L Nrf抑制剂ML385预处理2 h，其余处理方法同VPA+CCCP组）。上述处理完成后，取各组细胞检测氧化应激指标[活性氧（reactive oxygen species,ROS）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、丙二醛（malondialdehyde,MDA）]、细胞凋亡率，并行ALP、茜素红染色，以及Western blot检测成骨相关蛋白（BMP-2、RUNX2）、抗凋亡家族蛋白（Bcl2）、凋亡核心蛋白[活化半胱氨酸蛋白酶3(Cleaved-Caspase-3)、Bax]、通道蛋白（Nrf2）相对表达量。结果 经鉴定分离培养细胞为成骨细胞。根据CCK-8法检测结果，选择10μmol/L CCCP作用10 min建立成骨细胞氧化应激损伤模型，以及浓度0.8 mmol/mL VPA作用24 h进行后续实验。与空白对照组相比，CCCP组成骨细胞活性及矿化能力降低，ROS、MDA含量升高，SOD活性降低，细胞凋亡率升高，同时BMP-2、RUNX2、Bcl2蛋白相对表达量降低，Cleaved-Caspase-3、Nrf2和Bax蛋白相对表达量升高，差异均有统计学意义（P<0.05）;VPA+CCCP组进一步经VPA处理后，CCCP对成骨细胞的氧化应激损伤作用缓解，上述指标呈恢复趋势（P<0.05）；而VPA+CCCP+ML385组细胞上述指标则呈相反变化趋势（P<0.05）,VPA保护作用被逆转。结论 VPA通过调节Keap1/Nrf2/Are通路来抑制CCCP诱导的成骨细胞氧化应激损伤并促进成骨。
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单位皖南医学院第一附属医院
