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摘要
建立一种快速准确检测利什曼原虫的实时荧光定量PCR (qPCR)方法。以利什曼原虫动基体小环保守序列为靶基因,设计1对特异性引物和Taq-Man探针,以利什曼原虫阳性患者骨髓样品DNA为模板进行PCR扩增,扩增产物长83 bp。扩增产物连接至pESI-T载体进行克隆、测序,测序结果在GenBank上进行BLAST比对,结果显示,其序列与婴儿利什曼原虫和杜氏利什曼原虫的序列一致性为100%。取测序正确的质粒梯度稀释至102～107拷贝/μl作为标准品进行qPCR,绘制获得标准曲线方程y=39.23-2.956 x,扩增效率为117.93%,R2为0.994;当阈值循环数为35时,最低检测限为26.98拷贝/μl,理论上可检出小于1个利什曼原虫。用所建立的qPCR检测内脏利什曼病患者骨髓样品14份、血样26份,利什曼病病犬的骨髓、血液、脾、肺、淋巴结、肝、肾组织样品各1份,利什曼原虫阳性白蛉2份,患者和病犬骨髓培养物各1份,结果均为阳性;检测利什曼原虫血清抗体阳性犬骨髓9份,结果 7份阳性;检测利什曼原虫血清抗体阴性人群血样56份,沙门菌、志贺菌、蜡样芽胞杆菌DNA各1份,疟疾患者血样4份,刚地弓形虫病患者血样、卫氏并殖吸虫病患者血样各1份,结果均为阴性。所建立的qPCR具有较高灵敏度及特异度,可用于利什曼病患者、宿主动物、传播媒介利什曼原虫感染与带虫状态的快速检测,可用于患者的疗效判定。
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