基于CRISPR/cas9文库筛选的慢病毒库包装方法研究

作者：刘铁柱; 李阿茜; 李乃哲; 曲园园; 李川; 张全福; 刘洋; 李德新; 梁米芳; 王世文^*

来源：中华实验和临床病毒学杂志, 2019, (02): 207-211.

DOI：10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2019.02.020

• CRISPR/cas9文库筛选
• 慢病毒库包装
• 高通量测序技术

目的 探讨基于CRISPR/cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences/CRISPR-associated protein 9)文库筛选的慢病毒库包装优化条件。方法 采用RT-PCR、酶联免疫吸附试验(ELISA法)和免疫荧光法,对不同质粒配比、不同收毒时间以及不同量的Lipofectamine 3000 reagent包装出的慢病毒滴度进行检测,最后通过高通量测序技术评价慢病毒库的sgRNA(single guide RNA,单链引导RNA)覆盖度和reads数分布。结果 当质粒配比psPAX2∶pMD2.0G∶Lentivirus library＝2∶1∶1时,慢病毒滴度较高；当加入Lipofectamine 3000 reagent的量为10 μl时,慢病毒滴度较高。两种情况,RT-PCR和ELISA法结果一致。免疫荧光显示,收毒时间为60 h时慢病毒滴度较高。经Ion Torrent高通量测序,按照本研究的最优条件包装出的慢病毒库覆盖度达99.3%,sgRNA的reads数符合正态分布。结论 本研究探索了慢病毒库包装的优化条件,为下一步CRISPR/cas9文库筛选提供保证。

• 单位
  中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所