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摘要
目的构建人微小抗肌萎缩蛋白基因(microdystrophin)的真核表达载体,转染大鼠骨髓间充质干细胞(rMSC),研究其体外表达情况。方法限制性酶切PBSK-MICRO质粒的微小抗肌萎缩蛋白基因片段,插入到真核表达质粒pcD-NA3.1(+)的NotI位点内,克隆出真核表达载体pcDNA3.1(+)/micro dystrophin。通过酶切和测序对质粒进行鉴定。用脂质体将重组质粒转染入rMSCs中,经过G418筛选后,用RT-PCR及间接免疫荧光技术检测表达产物。结果pcDNA3.1(+)/micro dystrophin经过NotI、Hind III酶切鉴定及测序证实插入片断正确。提取转染重组质粒rMSCs的总RNA,进行RT-PCR可见mRNA的转录;对G418筛选后rMSCs进行免疫荧光检测可见细胞内亮丽的红色荧光,说明转染后的rMSCs有微小抗肌萎缩蛋白的表达。结论成功构建了人microdystrophin基因真核表达载体,将其转染入rMSCs内有微小抗肌萎缩蛋白的表达,为进一步研究体外修饰自体干细胞移植治疗DMD奠定了基础。
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