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摘要
目的为探讨Taq DNA聚合酶(后简称Taq酶)中5′~3′外切酶活性在Taqman探针法荧光定量PCR中的作用及影响,指导热启动Taq酶性能改造,本文研究了不同热启动Taq聚合酶的5′~3′DNA外切酶活性差异,以及该活性的高低对Taqman探针法荧光定量PCR的影响。方法使用荧光探针为底物,分别测定不同热启动Taq酶的聚合酶活性及外切酶活性,对比在相同聚合酶活性下外切酶活性的差异,以及在荧光定量PCR扩增反应中的差异。结果在聚合酶活性相等的条件下,不同的热启动Taq聚合酶具有不同的5′~3′DNA外切酶活性,经化学修饰的Taq酶的5′~3′DNA外切酶活性分别下降2.7倍和4.55倍,经抗体修饰的Taq酶5′~3′DNA外切酶活性没有变化。在乙型肝炎病毒(HBV)DNA荧光定量PCR检测体系中,加入同等聚合酶活性单位的不同修饰方法制备热启动Taq酶,外切酶活性高的酶比活性低的酶ct值更低。结论在Taqman探针法荧光定量PCR反应中,Taq酶对探针的外切降解过程是反应的限速步骤,提高Taq酶5′~3′DNA外切酶活性有利于提高反应效率。
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