乙型肝炎病毒感染肝脏类器官系统的建立与应用

作者：陈金梅; 沈乐而; 陈洁; 马思远; 臧国庆; 陈小华^*

来源：中华传染病杂志, 2023, 41(04): 263-268.

DOI：10.3760/cma.j.cn311365-20221024-00443

• 诱导多能干细胞
• 肝脏类器官
• HBV感染
• 核苷类药物

目的以诱导多能干细胞(iPSC)和倒置胶体晶体聚乙二醇支架(ICC)为基础构建乙型肝炎病毒(HBV)感染的肝脏类器官系统, 并验证核苷类药物的抗病毒作用。方法将iPSC分化诱导成肝细胞样细胞(HLC), 并接种至ICC中建立肝脏类器官系统。采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测Nanog同源框(NANOG)、性别决定区Y框(SOX)2、SOX17、叉头框蛋白A2(FOXA2)、甲胎蛋白、白蛋白的mRNA相对表达水平;应用激光共聚焦显微镜对类器官三维结构进行摄片;采用蛋白质印迹法和免疫荧光分析HLC中钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白(NTCP)表达水平。HepG2.2.15细胞提取HBV病毒颗粒感染肝脏类器官, RT-qPCR法检测细胞内HBV前基因组RNA(pgRNA)相对表达量;激光共聚焦显微镜下观察细胞质中乙型肝炎核心抗原(HBcAg)和乙型肝炎表面抗原(HBsAg)表达。分别以0.5 μmol/L恩替卡韦、0.5 μmol/L拉米夫定干预HBV感染细胞, 采用RT-qPCR法检测感染与未感染细胞内HBV pgRNA相对表达量。统计学分析采用独立样本t检验和单因素方差分析。结果 iPSC分化21 d内, 干细胞标志物NANOG、SOX2 mRNA表达水平降低(F=158.90、8.31, P<0.001, P=0.002), 内胚层SOX17、FOXA2 mRNA表达水平先升高后降低(F=37.23、82.57, 均P<0.001);分化后期, 肝细胞中甲胎蛋白、白蛋白mRNA表达水平升高(F=4.65、34.64, P=0.012, P<0.001), 差异均有统计学意义。蛋白质印迹法和荧光显微镜下显示分化后细胞中NTCP高表达, 其蛋白质相对表达水平为0.803±0.099, 激光共聚焦显微镜显示分化后肝细胞表达白蛋白, 在ICC中呈现三维球体结构。HBV pgRNA表达和HBsAg、HBcAg的免疫染色证实HBV成功感染肝脏类器官系统。核苷类药物作用类器官系统3 d后, 恩替卡韦组(0.665±0.220)和拉米夫定组(0.503±0.117)的HBV pgRNA水平较未感染细胞(3.347±0.454)明显下降, 差异均有统计学意义(t=10.53、12.72, 均P<0.001)。结论 iPSC分化后表现出肝脏特异性基因白蛋白和NTCP, 以iPSC和ICC构建的肝脏类器官系统具有人体肝脏功能, HBV能感染该系统, 恩替卡韦、拉米夫定能有效抑制肝细胞中HBV复制。

• 单位
  上海交通大学医学院附属第六人民医院