人源性促甲状腺激素受体单链抗体Fc融合蛋白的制备及鉴定

作者：吴黎黎; 贾健安; 邵璇璇; 黄保军^*

来源：中国免疫学杂志, 2020, 36(14): 1720-1723.

• 促甲状腺激素受体抗体
• 单链抗体
• 昆虫细胞
• 重组质粒
• 重组杆粒

目的:构建含有促甲状腺激素受体抗体(TRAb)单链抗体的重组载体pFastBacTM1-ScFv-IgG1Fc,通过Bac-to-Bac表达系统实现单链抗体融合蛋白的高效表达,并检测目的蛋白表达和免疫学活性。方法:TRAb抗体的重链可变区(HV)和轻链可变区(LV)的序列以linker(G4S)连接,构建ScFv;Genbank检索人IgG1Fc序列,SnapGene软件分析上述序列和载体pFastBacTM1,以基因合成方式构建重组质粒pFastBacTM1-ScFv-IgG1Fc;pFastBacTM1-ScFv-IgG1Fc转化感受态大肠杆菌DH10Bac生成重组杆粒,pUC/M13正向和反向引物进行PCR分析确认目的基因的序列;重组杆粒采用Cellfectin?Ⅱ试剂转染昆虫细胞Sf9生成P1病毒储液,继续感染Sf9生成高滴度的P2和P3病毒储液;P3病毒储液感染High FiveTM细胞,收集上清通过SPA-Sepharose CL-4B亲和层析纯化获得较纯的单链抗体融合蛋白,SDS-PAGE鉴定目的蛋白;化学发光和免疫组化检测目的蛋白抗原结合力。结果:PCR扩增得到约3 747 bp的基因序列,重组杆粒中目的基因正确插入;目的蛋白位于55 kDa附近且无杂带,纯度较高;目的蛋白浓度为248 U/L,单链抗体融合蛋白的结合力较好。结论:Bac-to-Bac表达系统成功构建并表达了TRAb单链抗体融合蛋白,抗原亲和力良好。

• 单位
  安徽医科大学