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摘要
【背景】对抗生素生物合成途径的阐明有助于创造出更高活性的化合物以及提高目标化合物的产量。基因同框缺失是天然产物生物合成研究的常规手段，通过分析突变菌株积累的中间产物，可以推导天然产物的合成途径相关基因的功能。天然产物生物合成基因簇一般在20 kb以上，对每个基因进行同框缺失是件耗时耗力的过程，因此优化链霉菌来源的基因同框缺失的方法有重要的意义。【目的】基于PCR-targeting，我们重新设计了一套在链霉菌柯斯文库质粒上进行基因同框缺失的方法，实现链霉菌基因在大肠杆菌中快速、高精确度的基因同框缺失的技术体系。【方法】我们使用氨苄青霉素抗性基因bla作为PCR-targeting DNA片段的筛选标记，同时使用体外的Pac Ⅰ酶切和酶连系统代替体内的Flp/FRT系统来介导同框缺失的构建。【结果】利用这种方法，我们6天内，完成了米多霉素生物合成基因簇中14个基因的同框缺失。【结论】此方法与传统的PCR-targeting方法相比，构建同框缺失载体的效率明显提高；且Pac Ⅰ识别序列在链霉菌基因组上的稀有性使得此方法在构建抗生素生物合成基因簇必需基因的同框缺失载体上具有普适性。
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单位生命科学技术学院; 上海交通大学; 微生物代谢国家重点实验室
