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摘要
目的探讨病毒巨噬细胞炎症蛋白Ⅱ(vMIP-Ⅱ)对载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3G(APOBEC3G)表达的影响及其机制。方法转染vMIP-Ⅱ质粒(vMIP-Ⅱ质粒组)、空质粒(空质粒组)至293T细胞。定量PCR和Western印迹法分析转染vMIP-Ⅱ基因对293T细胞APOBEC3G表达的影响。空质粒组、vMIP-Ⅱ质粒组细胞分别加入1 000 IU/ml干扰素α(IFN-α), 培养36 h后, Western印迹法检测空质粒组、vMIP-Ⅱ质粒组、空质粒+ IFN-α组、vMIP-Ⅱ质粒+ IFN-α组APOBEC3G的蛋白水平。对转染vMIP-Ⅱ质粒的293T细胞, 分别用75 μmol/L JAK/STAT信号通路抑制剂AG490和20 μmol/LERK信号通路抑制剂U0126处理, 24 h后收集细胞总蛋白, Western印迹法检测APOBEC3G蛋白水平。构建包含APOBEC3G启动子的荧光素酶报告基因重组质粒, 启动子片段包括APOBEC3G全长启动子序列(POS)与长度1 560、960、720、480、420、360、330、240 bp序列及APOBEC3G启动子序列中不含调控元件的区域(NEG), 将荧光素酶报告基因重组质粒和vMIP-Ⅱ质粒共转染293T细胞为实验组, 以与空质粒共转染的293T细胞为对照, 检测APOBEC3G启动子活性, 分析vMIP-Ⅱ调控APOBEC3G转录活性的关键启动子作用区域。统计学比较采用t检验、单因素方差分析、LSD-t检验。结果 vMIP-Ⅱ转染组APOBEC3G mRNA、蛋白水平(2.500 ± 0.013、1.472 ± 0.013)均高于对照组(1、0.364 ± 0.030, t值分别为6.22、6.54, 均P < 0.05)。空质粒组、vMIP-Ⅱ质粒组、空质粒+ IFN-α组、vMIP-Ⅱ质粒+ IFN-α组APOBEC3G水平(分别为1、2.030 ± 0.108、2.700 ± 0.081、2.600 ± 0.099)差异有统计学意义(F = 67.026, P < 0.001), vMIP-Ⅱ质粒组与空质粒+ IFN-α组差异无统计学意义(t = 3.46, P > 0.05)。vMIP-Ⅱ质粒组、vMIP-Ⅱ质粒+ AG490组、vMIP-Ⅱ质粒+ U0126组APOBEC3G水平(0.617 ± 0.025、0.179 ± 0.061、0.359 ± 0.012)差异有统计学意义(F = 70.019, P < 0.001), 后两组均低于vMIP-Ⅱ质粒组(t值分别为9.66、11.836, P < 0.01)。荧光素酶活性检测显示, 转染了POS、1 560、960、720、480、420、360、330、240 bp及NEG序列的vMIP-Ⅱ质粒组启动子活性差异有统计学意义(F = 81.092, P < 0.001), 从720 bp片段至480 bp片段, APOBEC3G启动子活性降低幅度巨大。结论 vMIP-Ⅱ上调APOBEC3G的表达, 可能是通过JAK/STAT信号通路或作用于APOBEC3G转录活性的关键启动子区域。
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