木本曼陀罗中一条新的TRI基因克隆与酶活功能鉴定

作者：强玮; 夏科; 赵许朋; 付维; 满建民; 张明生^*

来源：药学学报, 2019, 54(03): 574-581.

DOI：10.16438/j.0513-4870.2018-0994

• 托品酮还原酶
• 木本曼陀罗
• 托品烷生物碱
• 酶反应动力学

托品酮还原酶I(tropinone reductase I, TRI)是托品烷生物碱(tropane alkaloids, TAs)合成途径中游分支点处的关键酶,可引导托品酮代谢流进入TAs合成,因此是TAs代谢工程重要的靶标基因。本研究从木本曼陀罗(Datura arborea)中克隆到了一条新的TRI基因,命名为DaTRI2 (GenBank登录号为MH705164)。DaTRI2基因cDNA全长1 135 bp,与DaTRI序列一致性为96.8%,预测编码272个氨基酸。DaTRI2蛋白具备茄科TRI保守的结合NADPH的TGXXXGXG基序、结合底物托品酮的11个保守氨基酸残基以及发挥催化活性的N-S-Y-K四联体基序。进化关系上, DaTRI2和茄科的TRI成员聚为一支,与Datura属的TRI亲缘关系最近。对DaTRI2进行原核表达,纯化的重组蛋白能催化托品酮还原反应和托品氧化反应,最适pH值分别为8.0和9.6。DaTRI2在pH=6.4时,对托品酮的Km和Vmax分别为210.05μmol·L-1和69.6 nkat·mg-1 protein,在pH=9.6时,对托品的Km和Vmax分别为188.03μmol·L-1和114 nkat·mg-1 protein。qPCR检测表明DaTRI2在幼叶中表达量最高,其次是须根。DaTRI2基因的克隆和酶活力分析为深入研究木本植物中TAs的生物合成分子机制奠定了基础,同时为TAs代谢工程提供了一个更高效的候选靶基因。

• 单位
  广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所; 贵阳学院; 贵州大学; 生命科学学院