3种猪细胞因子mRNA实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

作者：王凤雪; 黄双; 刘莹; 杨勇; 孙娜; 朱洪伟; 张淑琴; 程世鹏; 温永俊

来源：中国畜牧兽医, 2015, 42(01): 24-31.

DOI：10.16431/j.cnki.1671-7236.2015.01.004

• 猪
• 细胞因子
• SYBR GreenⅠ
• 实时荧光定量RT-PCR

为建立猪细胞因子SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测方法,根据GenBank中3种重要的猪细胞因子即猪白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)、α-干扰素(interferonα,IFN-α)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)的基因序列,设计特异引物扩增目的基因。将3种基因克隆至pMD18-T载体上,得到各自阳性克隆质粒,以3种阳性质粒为标准品建立标准曲线并进行熔解曲线分析以及灵敏性、特异性和重复性试验。结果表明,当标准品稀释度为1×1011×106拷贝/μL时,3种基因的Ct值与浓度间具有良好的线性关系,相关系数均≥0.992。熔解曲线分析表明,产物为特异性单峰且重复性较好。应用建立的方法对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)TJM-F92株免疫的30日龄猪外周血单核细胞(PBMC)中IL-12、IFN-α和TNF-α表达量进行检测,结果发现,免疫了PRRSV TJM-F92株的猪PBMC细胞内3种细胞因子表达量均极显著升高(P<0.01)。研究结果为IL-12、IFN-α和TNF-α的定量分析提供了技术平台。

• 单位
  沈阳农业大学; 分子生物学国家重点实验室; 中国农业科学院特产研究所