绵羊肺炎支原体EF-Tu蛋白原核表达及ELISA方法建立

作者：陈思宇; 张梦洁; 田睿; 陈益; 刘镝钺; 李文良; 毛立; 程子龙; 杨蕾蕾; 孙敏; 张纹纹; 杜改梅; 储岳峰; 王金泉^*; 刘茂军^*

来源：中国动物传染病学报, 2023, 1-10.

DOI：10.19958/j.cnki.cn31-2031/s.20230321.001

• 绵羊肺炎支原体
• EF-Tu蛋白
• 原核表达
• 间接ELISA

绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae，Mo)是引起规模化羊场呼吸道病的主要病原，危害严重；快速特异诊断是防控该病的保障。本文旨在建立一种检测Mo血清抗体的间接ELISA方法，利用大肠杆菌的密码子偏好性优化Mo EF-Tu基因序列进行原核表达，纯化出高纯度重组EF-Tu蛋白，以纯化的EF-Tu为包被抗原，建立Mo间接ELISA抗体检测方法。结果显示，原核表达的EF-Tu蛋白分子质量约为45.4 ku，与预期相符；Western blot证实具有良好的反应原性；建立的间接ELISA方法最佳优化条件显示，包被抗原浓度为1.25 mg/L，37℃ 2 h；封闭条件为30 g/L BSA PBS，37℃ 1 h；待检血清1∶100稀释，37℃ 45 min；酶标二抗1∶20 000稀释，37℃ 30 min；底物TMB 37℃避光15 min；样品OD450值≥0.296时判定为阳性，OD450值≤0.265时判定为阴性，OD450值介于0.265和0.296之间则判为可疑；组内和组间变异系数均低于10%；用该方法与实验室所建Mo全菌蛋白间接ELISA检测方法对233份血清进行检测，两者特异性为90.70%，敏感性为82.69%，符合率约为87.12%。上述结果表明，本研究建立的间接ELISA方法具有良好的敏感性、重复性及特异性，为Mo的临床诊断，抗体监测等提供简单快速的血清学诊断方法，也为Mo抗体检测试剂盒的开发奠定了基础。

• 单位
  家畜疫病病原生物学国家重点实验室; 新疆农业大学; 金陵科技学院; 中国农业科学院兰州兽医研究所; 江苏省农业科学院