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摘要
目的：采用聚合酶链式反应(PCR)技术和胶体金技术建立一种呼吸道真菌感染核酸胶体金试纸条检测方法，并对其检测效果进行评价。方法：根据GenBank数据库选择真菌内转录间隔区(ITS)基因片段作为靶基因，应用DNAMAN软件对真菌ITS基因片段进行分析，并分别在真菌通用引物5’端用生物素(Biotin)和异硫氰酸荧光素(FITC)进行修饰标记；建立PCR体系，进行体系的最佳条件优化；确定胶体金免疫层析试纸条标记链霉亲和素的最佳标记量和质控线及检测线最佳包被物浓度，组装核酸胶体金试纸条，对试纸条的特异度、灵敏度、重复性和稳定性进行验证。结果：水煮法提取白假丝酵母菌、新生隐球菌和毛霉菌DNA，浓度为180μg·L-1以上，纯度为1.60～2.10；在pH 7.0条件下，每100μL胶体金溶液中制备胶体金标记链霉亲和素最佳标记量为3.3μg，质控线包被Biotin化牛血清白蛋白(BSA-Biotin)浓度为2.00 g·L-1，检测线包被抗FITC抗体浓度为1.00 g·L-1。核酸试纸条的特异度与电泳结果一致，仅白假丝酵母菌、新生隐球菌和毛霉菌出现阳性结果，与金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、乙型溶血性链球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌和大肠埃希菌等常见呼吸道感染细菌无交叉反应。灵敏度检测，白假丝酵母菌、新生隐球菌和毛霉菌的DNA浓度分别为10-4、10-2和10-3 mg·L-1时核酸试纸条仍可准确检出，而普通PCR电泳结果显示白假丝酵母菌、新生隐球菌和毛霉菌最低检测浓度分别为0.01、1.00和0.10 mg·L-1；重复性检测，在不同实验室不同操作人员对核酸试纸条进行验证，结果一致，重复性良好；稳定性检测，核酸试纸条在第6、9和12个月进行检测，结果符合预期，稳定性良好。结论：本研究建立的呼吸道真菌感染核酸胶体金试纸条可以检测白假丝酵母菌、新生隐球菌和毛霉菌等真菌，特异度和灵敏度均较高，操作简便且快速。
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单位北华大学附属医院; 北华大学
