DEK基因RNA干扰慢病毒表达载体的构建及其对肝癌细胞生物学行为的影响

作者：李术华; 侯宇; 陈哲; 吴韦铷; 吴传新; 孙航^*

来源：中华肝脏病杂志, 2020, 28(10): 868-875.

• 细胞增殖
• 细胞凋亡
• 细胞迁移
• DEK
• RNA干扰
• 慢病毒载体

目的构建DEK基因的RNA干扰(RNAi)慢病毒表达载体, 并探讨其对肝癌细胞生物学行为的影响。方法采用RNAi技术, 根据DEK基因的干扰序列, 合成Oligo DNA,退火形成双链DNA, 将其克隆到酶切后的小干扰RNA表达载体pLKO.1上, 构建重组慢病毒载体pLKO.1-sh hDEK, 经293T细胞包装, 收集病毒上清液, 感染细胞。采用实时逆转录PCR(RT-PCR)和免疫蛋白印迹法(Western blot)检测人肝癌细胞Bel-7402、Huh-7、SMMC-7721和HepG2中DEK的表达及感染慢病毒的各组细胞中DEK的敲低效率。分别通过细胞计数试剂盒-8(CCK8)增殖实验、流式细胞术、划痕实验检测细胞增殖能力、克隆形成能力、凋亡及迁移能力。两组间均数比较采用t检验, 多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。结果酶切鉴定和DNA测序结果证实, 重组慢病毒载体pLKO.1-sh hDEK1及pLKO.1-sh hDEK3构建成功。RT-PCR和Western blot结果显示, 肝癌细胞Bel-7402和Huh7中DEK的表达较高, pLKO.1-sh hDEK3能更有效地抑制DEK基因的表达(P < 0.05), 因此选择pLKO.1-sh hDEK3重组慢病毒感染肝癌细胞Bel-7402和Huh7进行后续的功能实验。CCK8细胞增殖实验结果显示肝癌细胞Bel-7402和Huh7感染重组慢病毒后, 细胞增殖能力与空白对照及阴性对照相比减弱(P < 0.05);细胞凋亡结果显示敲低组细胞凋亡率高于空白对照及阴性对照组(P < 0.05);细胞划痕实验结果显示敲低组划痕愈合率低于空白对照及阴性对照组(P < 0.05), 差异均有统计学意义;而空白对照及阴性对照组比较, 差异无统计学意义。结论靶向沉默肝癌细胞中DEK的表达, 能够抑制细胞增殖及迁移能力, 并诱导凋亡, 为进一步研究DEK基因在肝癌中的作用奠定基础。

• 单位
  中国人民解放军陆军军医大学; 重庆医科大学附属第二医院; 重庆医科大学