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摘要
目的 克隆表达白纹伊蚊唾液腺34ku-1蛋白(Aalb＿34 ku-1),并制备鼠抗34ku-1多克隆抗体，用于蚊唾液34ku-1蛋白的检测。方法 根据白纹伊蚊罗马株(GenBank:AY826117.1)34ku去除信号肽后的基因序列设计特异性引物，采用RT-PCR技术从白纹伊蚊安顺株雌蚊体内扩增获得34ku-1基因。利用美国国家生物技术信息中心(NCBI)、瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统(ExPASy)等对该蛋白进行生物信息学分析。将该基因构建到原核表达质粒pET-32a(+)中，转染大肠埃希菌BL21(DE3)后经异丙硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导表达目的蛋白，SDS-PAGE电泳分析表达结果。镍柱纯化34ku-1重组蛋白，采用Western blot验证纯化蛋白的免疫反应性。用纯化的34ku-1重组蛋白免疫BALB/c小鼠，制备免疫血清，采用间接ELISA法检测血清抗体效价，采用Western blot方法对抗体的特异性进行鉴定。收集雌蚊唾液，采用Western blot方法用制备的多克隆抗体检测蚊唾液34ku-1蛋白。结果 成功克隆获得34ku-1基因，生物信息学分析该基因全长888 bp,编码295个氨基酸。编码蛋白的理论分子质量单位为33.6 ku,等电点为5.54。重组质粒pET-32a(+)-34ku-1经PCR、双酶切及测序验证构建正确。经IPTG诱导的BL21重组菌表达产物主要以包涵体形式存在。经亲和层析法获得高纯度的34ku-1重组蛋白，浓度为0.71 mg/mL。Western blot显示重组蛋白可被抗6-His tag抗体识别，制备的鼠抗34ku-1血清抗体效价为1∶625 000,且特异性良好，用34ku-1多克隆抗体Western blot可检测到蚊虫唾液中的34ku-1蛋白。结论 成功克隆并表达了白纹伊蚊34ku-1原核蛋白，制备了高效价、高特异性的鼠抗34ku-1多克隆抗体，应用该抗体可检测到雌蚊唾液中的34ku-1蛋白。
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单位基础医学院; 贵州医科大学
