大肠杆菌Targetron基因打靶载体构建及应用

作者：黄瑾; 陈相好; 吴晓娟; 张峥嵘; 谷俊莹; 陈峥宏^*; 崔古贞^*

来源：贵州医科大学学报, 2019, 44(07): 745-750.

DOI：10.19367/j.cnki.1000-2707.2019.07.001

• 型内含子
• 打靶载体
• 大肠杆菌
• 重叠延伸PCR
• Targetron基因

目的:构建基于细菌Ⅱ型内含子的Targetron基因打靶载体,并在大肠杆菌中验证其功能。方法:以构建的p SY7载体为基础、以大肠杆菌lac Z基因为例,选择lac Z-1683a和lac Z-1874s位点为靶位点,利用在线设计软件设计打靶引物,通过重叠延伸PCR方法获得特异性打靶序列,并将其克隆到p SY7载体,获得p SY7-lacZ-1683a和p SY7-lacZ-1874s打靶载体,转化大肠杆菌后利用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导插入型内含子的表达,最后利用菌落PCR和蓝白斑计数法验证其功能及打靶效率。结果:成功构建了p SY7-lacZ-1683a和p SY7-lac Z-1874s两种Targetron打靶载体,通过0.5 mmol/L IPTG诱导45 min后,菌落PCR显示Ⅱ型内含子能特异性插入到lac Z-1683a、lac Z-1874s位点,蓝白斑计数显示lac Z-1683a位点的打靶效率为(14.299±1.271)%,lac Z-1874s位点的打靶效率为(9.217±1.024)%。结论:构建的Targetron打靶载体能够特异性的插入大肠杆菌染色体靶位点。

• 单位
  贵州医科大学; 基础医学院