非洲猪瘟病毒一步法巢式锁核酸荧光定量PCR方法的建立

作者：施科达; 徐民生; 李艳; 张昆丽; 翟少伦; 勾红潮; 宋帅; 杨冬霞; 臧莹安; 孙铭飞; 李春玲

来源：中国农学通报, 2023, 39(11): 143-151.

• 非洲猪瘟病毒
• B646L(P72)蛋白基因
• 锁核酸修饰
• 一步法巢式荧光定量PCR

试验基于非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）B646L（P72）蛋白基因序列，建立一种高灵敏度和高特异性的检测方法。采用Oligo 7软件设计一步法巢式锁核酸荧光定量PCR（One Step NestedLocked Nucleic Acid real-time PCR,LNA-OSN-PCR）的嵌套引物以及探针，并对外引物进行锁核酸修饰。建立并优化LNA-OSN-PCR反应体系和条件，确立LNA-OSN-PCR标准曲线，并检验LNA-OSN-PCR方法的灵敏度、特异性和重复性。采用LNA-OSN-PCR方法，对96份临床疑似患病样品进行检测，同时与普通荧光探针PCR方法进行比较。试验确立并优化了LNA-OSN-PCR的反应条件和体系，建立的LNA-OSN-PCR标准曲线，具有较好的线性（R2=0.9945）。该方法的最低检测限为3×10-1copies/μL，变异系数小于3%，并且与其他病毒或细菌核酸无交叉反应。LNA-OSN-PCR方法与OIE推荐的荧光定量PCR方法比较，检测灵敏度提高10～100倍，在对96份临床疑似患病核酸样品进行检测中，检出55份阳性，41份阴性，比常规的荧光定量PCR具有更高的阳性检出率。并且能获得典型的扩增曲线。试验结合一步法巢式PCR和锁核酸修饰，建立了ASFV一步法巢式锁核酸荧光定量PCR，为检测ASFV提供一种高灵敏度和高特异性且经济实惠的检测方法。