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摘要
目的探讨马尾松针提取物(PMNE)对人毛乳头细胞(HDPC)抗氧化应激的保护作用及机制。方法以HDPC为研究对象, 分别采用0(对照组)、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 mmol/L H2O2处理HDPC, 建立体外HDPC氧化应激的最佳条件;在HDPC中转染核因子E2相关因子2(Nrf2)干扰片段siRNA1、siRNA2、siRNA3或过表达质粒pCMV6-XL5-Nrf2, 实时荧光定量PCR和Western印迹法分别检测Nrf2 mRNA及蛋白的表达;H2O2条件下检测转染后各组细胞活性及凋亡率。常规培养HDPC并分组处理, 对照组:正常培养, 不予其他处理;双氢睾酮组:加入0.03 μg/ml双氢睾酮;原花青素组:加入0.03 μg/ml双氢睾酮和6.00 μg/ml原花青素B2处理;不同浓度PMNE组:加入0.03 μg/ml双氢睾酮培养液, 同时分别给予1、5、25、100 μg/ml PMNE处理;分别检测各组细胞活性及凋亡率、细胞内活性氧(ROS)相对荧光强度和丙二醛(MDA)含量, Nrf2、醌氧化还原酶1(NQO1)、血红素加氧酶1(HO-1)、Kelch样ECH相关蛋白1(Keap1)、转化生长因子(TGF)-β1、Sma和Mad相关蛋白2/3(Smad2/3)、p-Smad2/3的表达水平。多组间比较采用单因素方差分析, 组间两两比较采用LSD-t检验。结果 HDPC细胞活力为75% ～ 85%时, 选择0.4 mmol/L H2O2作为体外HDPC氧化应激最适处理浓度。Nrf2-siRNA1、Nrf2-siRNA2、Nrf2-siRNA3组Nrf2 mRNA和蛋白表达均显著低于空白组和对照组(均P < 0.05), 细胞凋亡率(12.50% ± 0.05%、26.07% ± 0.05%、58.44% ± 1.03%)均显著高于空白组(10.38% ± 0.64%)和对照组(13.05% ± 0.12%), 均P < 0.05。Nrf2-siRNA2组的Nrf2蛋白表达量最低, 选择Nrf2-siRNA2为最佳干扰片段进行后续实验。Nrf2过表达组Nrf2 mRNA和蛋白表达均显著高于空白组和对照组(均P < 0.05), 其细胞凋亡率明显低于空白组和对照组(均P < 0.05)。0.4 mmol/L H2O2处理条件下, Nrf2过表达组细胞凋亡率显著低于过表达空载组(t = 3.66, P < 0.001), 细胞活性高于过表达空载组(t = 40.40, P < 0.001);Nrf2-siRNA2组细胞凋亡率显著高于对照组(t = 13.13, P < 0.001), 而细胞活性显著低于对照组(t = 67.37, P < 0.001)。PMNE处理实验中, 原花青素组和不同浓度PMNE组细胞活性均显著高于双氢睾酮组(均P < 0.01), 而细胞凋亡率显著低于双氢睾酮组(均P < 0.01);原花青素和不同浓度PMNE均能显著抑制双氢睾酮诱导的HDPC细胞内ROS和MDA的过度表达(均P < 0.01);原花青素组和5、25、100 μg/ml PMNE组Nrf2、NQO1、HO-1蛋白表达显著高于双氢睾酮组(均P < 0.05), 原花青素组和25、100 μg/ml PMNE组Keap1、TGF-β1蛋白表达及Smad2/3磷酸化水平显著低于双氢睾酮组(均P < 0.05)。结论 Nrf2在抵抗HDPC的氧化应激损伤中起重要作用, PMNE可能通过激活Nrf2抗氧化反应元件通路而对HDPC产生明显的保护作用。
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