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摘要
目的 研究p5 3核输入功能在鼠双微体 2 (murinedoubleminute 2 ,MDM2 )调节的p5 3降解与泛素化中的作用。方法 由直接点突变的方法构建质粒 ,将决定p5 3 GFP核位置信号 (NLS)的两个部分 5个基本氨基酸 (赖氨酸和精氨酸 )单一替换为丙氨酸 ,构建了p5 3 NLS突变型p5 3KRKKK GFP ,并且经DNA序列确定。用DNA克隆技术将p5 3KRKKK与pEGF Nuc融合 ,构建了p5 3KRKKK NLS GFP ,然后分别转染U2OS细胞 ,在荧光显微镜下直接观察活细胞的蛋白表达部位 ;同时用间接免疫荧光染色、Westernblot和泛素化分析的方法 ,观察p5 3KRKKK与MDM2野生型或MDM2 NLS突变型共转染U2OS细胞时的蛋白表达部位、降解和泛素化现象。结果 p5 3KRKKK GFP蛋白表达完全在细胞浆 ,并且不能被野生型和NLS突变型的MDM2降解 ,但是可以被泛素化。p5 3KRKKK NLS GFP可以使p5 3蛋白表达重新回到细胞核 ,此时能被MDM2野生型和NLS突变型降解和泛素化。p5 3野生型和NLS突变型均可被MDM2野生型和NLS突变型泛素化 ,当p5 3KRKKK和MDM2 NLS同时表达在细胞浆时 ,p5 3蛋白出现了更高效率的泛素化 ,但不能被降解。结论 p5 3核输入对由MDM2调节的p5 3降解是必须的 ;MDM2调节的p5 3泛素化可以出现在细胞浆 ,而且效率更高。
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