人肝素酶RNAi序列的筛选及鉴定

作者：熊震; 汤旭东; 房殿春; 陈婷; 余松涛; 陈陵; 罗元辉; 杨仕明

来源：第三军医大学学报, 2007, (20): 1929-1932.

• 人肝素酶
• RNA干扰
• siRNA
• 肝癌

目的筛选及鉴定有效人肝素酶(heparanase,Hpa)RNA干扰(RNA interference)序列。方法通过在线网络软件选择3个Hpa RNAi的靶点,再设计1组无关序列作阴性对照。通过基因重组技术,把3个干扰片段及阴性对照片段分别克隆入质粒pGenesile-1,脂质体法稳定转染至HepG2肝癌细胞;经G418抗性筛选后各挑选2个阳性克隆进行扩大培养;Western blot检测不同克隆肝素酶蛋白的表达水平,并进一步采用RT-PCR验证筛选克隆肝素酶mRNA的表达水平。结果通过在线网络软件设计3个RNA干扰序列,分别为Hpa/RNAi-1:GGCTATCTCTTCTGTTCAA,Hpa/RNAi-2:TCCT-GTCCGTCACCATTGA,Hpa/RNAi-3:CTCAGTTGCTCCTGGACTA及阴性对照序列Hpa/RNAi-N:CTACCGTTGTATAGGTGT;测序证实克隆入pGenesil-1载体的3个干扰序列及阴性对照序列与设计序列完全一致;经G418抗性筛选后形成的阳性克隆采用Western blot检测其肝素酶蛋白的表达,结果表明3个干扰序列对HepG2细胞人肝素酶蛋白的表达均有抑制作用,其中Hpa/RNAi-1和Hpa/RNAi-3干扰链的抑制效果最好,分别达到57%和71%;RT-PCR检测结果亦表明Hpa/RNAi-1和Hpa/RNAi-3序列在mRNA水平对肝素酶有较好的抑制效果。结论成功筛选出有效的人肝素酶RANi序列。

• 单位
  第三军医大学西南医院