一种用于Red同源重组的正反筛选表达盒的构建及其反向筛选性能分析

作者：刘金泽; 刘云惠; 余子豪; 李永霞; 王明晓; 张远星; 李**; 李倩文; 余旭平^*

来源：中国预防兽医学报, 2018, 40(10): 902-907.

• Red重组
• rpsL基因
• 基因敲除
• 大肠杆菌
• flgK基因

为建立能够应用于大肠杆菌基因无痕敲除的方法,本研究分别从大肠杆菌TG1基因组和pKD13质粒中扩增出链霉素敏感基因(strS,即rpsL基因)和卡那抗性基因(kanR),采用重叠延伸PCR方法将strS基因和kanR基因拼接,并将拼接片段分别克隆于pMD18-T和pBAD33载体中,再以重组载体为模板,以带有flgK基因同源臂的引物扩增获得PlacstrS-kanR打靶片段和ParastrS-kanR打靶片段,然后结合Red重组技术构建了相应的flgK基因敲除菌株placSK-ΔflgK/TOP10和paraSK-ΔflgK/TOP10,并通过链霉素最小抑菌浓度(MIC)试验检测两种筛选系统的反向筛选性能。结果显示,野生型TOP10菌株、placSK-ΔflgK/TOP10菌株和paraSK-ΔflgK/TOP10菌株的链霉素MIC值分别为8 000μg/mL、2 000μg/mL和500μg/mL。表明采用两种筛选系统构建的敲除菌株均有一定的链霉素敏感表型,具有反向筛选的能力,但含Para启动子的筛选系统反向筛选性能更好。本研究建立了可用于大肠杆菌Red重组技术的反向筛选系统,为获得更有效的Red重组筛选工具提供了依据。

• 单位
  浙江大学; 动物科学学院