新型冠状病毒木瓜样蛋白酶在大肠杆菌中的可溶表达与酶活性测定

作者：闫干干; 李淼; 戚海燕; 刘志成; 闫浩浩; 刘晓丽; 刘晓平^*; 陈云雨^*

来源：中国现代应用药学, 2022, 39(01): 5-11.

DOI：10.13748/j.cnki.issn1007-7693.2022.01.002

• 新型冠状病毒
• 木瓜样蛋白酶
• 原核表达
• 亲和层析
• 荧光共振能量转移

目的制备高活性的新型冠状病毒木瓜样蛋白酶(papain-like protease,PLpro),为PLpro小分子抑制剂高通量筛选模型的建立奠定基础。方法将密码子优化的新型冠状病毒PLpro基因连接到pET-28a载体中,构建重组质粒pET-28a-PLpro。将重组质粒转化到Escherichia coli Rosetta(DE3)感受态细胞中,以十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)鉴定PLpro的原核表达。采用低温诱导策略进行PLpro的可溶表达后,以HisTrapTM亲和层析柱分离纯化PLpro,再以荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)法测定PLpro的米氏常数(Michaelis constant,Km)值及其水解活性。结果基因测序与双酶切试验结果表明,成功构建了重组质粒pET-28a-PLpro。SDS-PAGE结果表明,PLpro在大肠杆菌中呈可溶表达,且纯化的PLpro纯度>90%。FRET结果表明,纯化的PLpro具有良好的水解活性,其Km值为25.38μmol·L-1。结论新型冠状病毒PLpro在大肠杆菌中成功地进行了可溶表达,且具有良好的酶活性。

• 单位
  皖南医学院; 长春生物制品研究所