OC-STAMP基因过表达载体及稳转细胞系的构建

作者：袁慧敏; 何茳萍; 张光亚; 张丹丹; 陈凤玲

来源：遵义医学院学报, 2017, 40(02): 143-149.

DOI：10.14169/j.cnki.zunyixuebao.2017.0032

• 破骨细胞多次跨膜蛋白
• 质粒构建
• 病毒转染
• RAW264.7细胞

目的构建破骨细胞多次跨膜蛋白（OC-STAMP）基因过表达质粒,体外转染RAW264.7细胞构建稳转细胞系,为进一步研究OC-STAMP的功能提供工具。方法根据NCBI数据库中OC-STAMP基因信息,设计引物,采用PCR扩增其基因片段;运用基因重组方法双酶切目的基因,并将其克隆至含有绿色荧光蛋白（GFP）的p CDH-CMV慢病毒载体,经酶切测序对重组质粒进行鉴定;转染成功构建的质粒至293T细胞中Western blotting验证蛋白过表达情况;采用ps PAX2和p MD2.G两种包装质粒包装p CDH-CMV-oc-stamp重组质粒获得病毒液,病毒感染RAW264.7细胞获得OC-STAMP过表达稳转细胞系,Q-PCR和Western blotting验证蛋白过表达情况。结果酶切和测序鉴定表明成功构建p CDH-CMV-oc-stamp的基因重组质粒;将成功构建的p CDH-CMV-oc-stamp质粒转染至293T,可观察到大量绿色荧光表达;将成功包装获得的病毒液感染RAW264.7细胞后q-PCR及Western blotting结果证实OC-STAMP成功过表达。结论成功构建p CDH-CMV-oc-stamp重组质粒及OC-STAMP过表达的稳转细胞系。

• 单位
  蚌埠医学院; 上海交通大学医学院附属第九人民医院