小麦淀粉分支酶CRISPR/Cas9基因敲除系统gRNA表达载体构建

作者：李苗; 陈晓军; 马斯霜; 白海波; 郑国保; 朱金霞; 张源沛^*

来源：分子植物育种, 2019, 17(20): 6668-6672.

DOI：10.13271/j.mpb.017.006668

• 小麦(Triticum aestivum L.)
• CRISPR/Cas9系统
• 淀粉分支酶基因
• gRNA
• 载体构建

本研究以小麦淀粉分支酶(starch branching enzyme, SBEIIa)为研究对象,选取SBEIIa基因外显子5’端的第一及第二个外显子区域的4个SBEIIa-gRNA参试靶点进行靶位点活性检测,确定最佳基因敲除靶点。采用试剂盒法,以选定基因敲除靶点序列设计gRNA引物,通过oligo二聚体(Oligoduplex)合成、oligo二聚体插入载体、转化及鉴定等步骤,构建具有表达小麦淀粉分支酶gRNA (guide RNA)的CRISPR/Cas9基因敲除系统,获得小麦淀粉分支酶基因敲除载体。根据载体中插入序列,进行测序分析;测序结果能够确认gRNA已经完整准确地连入载体。研究构建的小麦淀粉分支酶基因敲除载体能对小麦SBEIIa基因表达量进行负向调控,对后续小麦淀粉分支酶基因及向其它相关基因编辑调控研究提供科学依据。

• 单位
  宁夏农林科学院农业生物技术研究中心