蛋白质工程改造磷脂酶D提高磷脂酰丝氨酸产量

作者：冯小娜; 齐娜; 宋伟; 刘佳; 刘立明; 吴静^*

来源：食品工业科技, 2020, 41(17): 98-103+108.

DOI：10.13386/j.issn1002-0306.2020.17.016

• 蛋白质工程
• 磷脂酶D
• 磷脂酰丝氨酸
• 催化通道
• 催化距离
• 定点突变

为了进一步提高磷脂酰丝氨酸(PS)产量,将来源于Streptomyces katrae的野生型磷脂酶D(SkPLD)于E.coli BL21(DE3)中进行异源表达,获得菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-SkPLD,以磷脂酰胆碱(PC)和L-serine为底物,发现限制PS产量进一步提高的限制因素是转磷脂酰反应转化率低(<35%)而水解反应转化率过高(>30%)。在对SKPLD结构进行详尽分析的基础上,通过蛋白质工程改造策略扩大底物催化通道,降低位阻效应;同时提高His462与L-serine的亲和力,降低水解反应。结果表明,获得4个有益单突变体(Y405A、Q407G、D370P、K478P),对其进行组合突变,获得四突变体SkPLDY405A/Q407G/D370P/K478P,转化率、PS产量、kcat/Km分别为55.6%、42.3 g·L-1、1.53 (mmol/L)-1s-1,比野生型分别提高了59.8%、59.6%、93.7%。PS产量进一步提高的原因在于四突变体催化腔体积扩大到718.6■3,且His462 N原子与L-serine O原子的催化距离(d1)缩短0.6■,与H2O O原子的距离(d2)增加0.8■。在3 L规模转化体系中,PS产量为50.4 g·L-1、转化率达到66.3%,时空产率为12.6 g/L/h。本研究利用蛋白质工程改造获得了转磷脂酰活性提高的突变体,为提高磷脂酶D的工业生产奠定了坚实的基础。

• 单位
  江南大学; 食品科学与技术国家重点实验室