牛绝对端粒长度测定及DNA提取造成的影响

作者：鲍莉雯; 蔡勤; 周一叶; 许淼; 舒娟; 李华; 李虹雨; 曾溢滔; 曾凡一^*

来源：中国生物工程杂志, 2023, 43(08): 63-71.

DOI：10.13523/j.cb.2211008

• 端粒长度
• qPCR
• TRF
• DNA提取方法

目的：端粒是真核生物染色体末端的一种高度保守的负责维持染色体稳定的特殊结构，其DNA序列长度即端粒长度，会随着年龄增长或疾病发生发展而逐渐缩短，检测端粒长度可以为评估机体衰老和健康状况提供参考，但目前缺乏测定微量牛DNA样本绝对端粒长度的方法；通过实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR, qPCR)实现微量牛DNA样本绝对端粒长度的测定并评估DNA提取方法对牛绝对端粒长度测定结果的影响，为进行端粒长度研究时选择合适的DNA提取方法和端粒长度分析方法提供参考。方法：利用标准曲线对检测样本的端粒和内参Ct值进行转换，通过qPCR测定牛端粒长度绝对值；采用膜吸附法、苯酚-氯仿法和磁珠法3种方法分别提取相同样本的DNA,分别用端粒末端限制性片段(terminal restriction fragment, TRF)分析法和qPCR法分析端粒长度，比较不同DNA提取方法对牛绝对端粒长度测定的影响。结果：(1)qPCR可以测定纳克级别DNA样本的绝对端粒长度，检测结果重复性良好，并且和“金标准”TRF测定结果的相关性良好。(2)不同方法提取的DNA用TRF分析法和qPCR法测定端粒长度时，结果有显著差异，其中磁珠法提取的DNA在用2种不同方法进行端粒长度测定时，测定结果的一致性最好。结论：qPCR法是较TRF分析法更加灵敏的端粒长度绝对值测定方法，适合微量DNA样本的测定，且方便快捷；DNA提取方法会影响端粒长度的测定结果，在测定时应统一样本的DNA提取方法，磁珠法是相对更优的选择。

• 单位
  上海市儿童医院; 基础医学院; 上海交通大学