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摘要
为探究细胞程序性坏死的关键蛋白受体相互作用蛋白激酶-3 (RIP3)对A型塞内卡病毒(SVA)复制的影响及其潜在的作用机制，本研究采用SVA (MOI 1)感染PK-15细胞(PK-15+SVA),PK-15细胞作为对照组(Mock)，采用western blot检测RIP3、磷酸化的RIP3 (P-RIP3)、混合谱系激酶结构域样蛋白(MLKL)与磷酸化MLKL(P-MLKL)蛋白表达。结果显示，SVA感染促进PK-15细胞中P-RIP3和P-MLKL蛋白表达量显著增多(P<0.05)，表明SVA可激活程序性坏死相关蛋白RIP3和MLKL。利用RIP3特异性抑制剂GSK843处理PK-15细胞(PK-15+SVA+GSK843)，在SVA (MOI 1)感染12 h、24 h和48 h后，利用western blot和qPCR检测SVA非结构蛋白3D的表达水平和SVA mRNA (24 h)的转录水平。结果显示，与Mock组相比，感染细胞中SVA 3D蛋白和SVA mRNA转录水平均显著增加(P<0.05)。利用western blot检测细胞自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)的表达；采用SVA感染敲低自噬蛋白5 (ATG5)的PK-15细胞(ATG5 KD)，利用western blot检测其中SVA 3D蛋白的表达；利用qPCR检测各组细胞中IL-6、IL-1β、TNF-α和IFN-β mRNA转录水平。结果显示，与Mock组相比，PK-15+SVA细胞中LC3-Ⅰ的变化不明显，LC3-Ⅱ蛋白表达水平明显下调；与PK-15+SVA组相比，PK-15+SVA+GSK843细胞中LC3-Ⅰ变化不明显，LC3-Ⅱ蛋白表达水平则明显增加。与SVA感染的PK-15细胞相比，SVA感染ATG5 KD中3D蛋白表达水平明显下降。qPCR结果显示，与未感染SVA的对照组相比，PK-15+SVA中4种细胞因子mRNA转录水平均显著或极显著上调(P<0.05、P<0.001、P<0.0001)，与PK-15+SVA组相比，PK-15+SVA+GSK843细胞中4种细胞因子mRNA转录水平均显著或极显著下调(P<0.05、P<0.001、P<0.0001)。本研究上述结果首次表明RIP3可调控细胞自噬，影响SVA的复制，并参与调控细胞自噬的发生与炎性细胞因子的转录，该结果为进一步阐明SVA的致病机制及其感染的防治提供重要的科学依据。
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