新型冠状病毒巢式PCR检测方法的建立与初步应用

作者：石伟先; 冯兆民; 崔淑娟; 潘阳; 钱城; 辛若雷; 杨鹏; 王全意; 张代涛; 高志勇^*

来源：中华实验和临床病毒学杂志, 2022, 36(02): 214-218.

• 新型冠状病毒
• 实时荧光PCR法
• 巢式PCR法

目的建立一种检测新型冠状病毒的巢式PCR方法, 作为实时荧光PCR法检测新型冠状病毒的补充, 并探讨该方法在临床样本检测中的初步应用价值。方法根据新型冠状病毒基因保守序列, 利用在线软件设计N、S基因引物, 构建巢式PCR反应体系, N基因巢式PCR及产物测序用于定性检测, S基因PCR产物测序用于型别初步鉴定。检测梯度稀释新型冠状病毒阳性样本评价检测灵敏度, 检测流感病毒和人冠状病毒OC43、229E、HKU1、NL63等样本评价其特异性。分别检测Ct值>33与Ct值<33的各15份新型冠状病毒阳性样本, 对扩增产物进行测序及比对分析, 对检测方法进行验证。结果所建立的巢式PCR法可扩增出355 bp N基因片段及449 bp S基因片段的特异性条带, 冠状病毒229E、OC43、HKU1、NL63、H3N2亚型流感病毒、甲型H1N1流感病毒、乙型流感病毒阳性样本无扩增条带。N基因片段最低检测限可达Ct值37.21。30份新冠核酸阳性样本中, 巢式PCR检测的N基因阳性符合一致率达100%(30/30);S基因阳性符合一致率达60%(18/30)。28份样本N基因片段测序成功, BLAST与新型冠状病毒相似性100%。12份样本S基因片段可获得位点突变特征结果。结论建立了可特异检测新型冠状病毒的巢式PCR方法, 并可通过对PCR扩增产物测序分析其位点突变特征, 可作为实时荧光PCR法的补充。

• 单位
  北京市疾病预防控制中心