稳定干扰Drp1基因的慢病毒载体质粒及神经母细胞瘤细胞株构建

作者：周梦琪; 柴原; 冯琬迪; 马浩洁; 盖聪; 孙红梅^*

来源：山东医药, 2019, 59(24): 1-4.

• Drp1基因
• RNA干扰
• 慢病毒载体质粒
• 神经母细胞瘤细胞株
• 帕金森病

目的构建稳定干扰Drp1基因的慢病毒载体质粒及神经母细胞瘤细胞株,为进一步探讨Drp1基因在帕金森病(PD)发病过程中的作用提供细胞模型。方法于Gen Bank中检索人Drp1基因的核苷酸序列,设计并筛选最佳动力学参数的干扰序列及阴性对照序列;根据靶序列分别设计并合成干扰RNA(siRNA)的单链DNA寡核苷酸(DNA oligo),与退火缓冲液反应后形成带黏性末端的双链DNA oligo片段。分别用AgeⅠ与EcoRⅠ双酶切双链DNA oligo片段和GV248慢病毒骨架质粒后,加入T4 DNA连接酶连接,得到重组慢病毒载体质粒Drp1-RNAi和阴性对照质粒。将重组慢病毒载体质粒Drp1-RNAi加入到大肠杆菌TOP10感受态细胞中反应后,分别提取质粒DNA并进行DNA测序。将重组慢病毒载体质粒Drp1-RNAi和阴性对照质粒转染至293T细胞中,培养48 h后收集上清液,离心后过滤得到Drp1-RNAi重组慢病毒和阴性对照慢病毒。将人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y分为Drp1-RNAi重组慢病毒组(D组,用Drp1-RNAi重组慢病毒感染)、阴性对照组(N组,用阴性对照慢病毒感染)、正常对照组(C组,正常培养),采用实时荧光定量PCR法检测各组细胞Drp1 mRNA,采用Western blotting法检测各组细胞Drp1蛋白。结果重组慢病毒载体质粒Drp1-RNAi的DNA序列与设计的干扰序列完全一致。D组Drp1 mRNA和蛋白的相对表达量为0.47±0.12和0.40±0.04,N组Drp1 mRNA和蛋白的相对表达量为1.12±0.33和0.67±0.05,C组Drp1 mRNA和蛋白的相对表达量为1.02±0.23和0.72±0.02;D组Drp1 mRNA和蛋白的相对表达量与N组、C组相比,P均<0.05;N组Drp1 mRNA和蛋白的相对表达量与C组相比,P均>0.05。结论成功构建了稳定干扰Drp1基因的慢病毒载体质粒,并建立、筛选出了稳定干扰Drp1基因的神经母细胞瘤细胞株,进一步探讨Drp1基因在PD发病过程中的作用提供细胞模型。

• 单位
  北京中医药大学