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摘要
目的探讨miR-520c-3p对糖尿病肾脏病患者近端肾小管上皮细胞焦亡的影响及其分子机制。方法收集2019年6月至2020年12月在郑州大学第一附属医院就诊的糖尿病肾脏病患者(DKD组, 4例)和糖耐量正常肾脏肿瘤手术者(正常对照组, 4例)的肾脏组织。HE染色、过碘酸-希夫染色(PAS)和透射电镜观察肾脏组织病理学变化。取生长状态良好的人近端肾小管上皮(HK-2)细胞传代至培养板内, 并分成如下8组:正常葡萄糖组(NG, 5.6 mmol/L葡萄糖)、高糖组(HG, 30.0 mmol/L葡萄糖)、抑制物组(正常葡萄糖+转染miR-520c-3p抑制物)、抑制物对照组(正常葡萄糖+转染miR-520c-3p抑制物阴性对照物)、模拟物组(高糖+转染miR-520c-3p模拟物)、模拟物对照组(高糖+转染miR-520c-3p模拟物阴性对照物)、模拟物+TXNIP共转染组(高糖+共转染miR-520c-3p模拟物+TXNIP)、共转染阴性对照组(高糖+共转染miR-520c-3p模拟物+TXNIP阴性对照物)。活细胞动态实时监测细胞活性, 碘化丙啶(PI)染色检测细胞焦亡情况;免疫荧光染色、荧光原位杂交、实时定量PCR和Western blotting法检测miR-520c-3p、硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)和细胞焦亡分子NOD样受体蛋白3(NLRP3)、活化半胱氨酸蛋白酶-1(cl-caspase-1)、消皮素D(GSDMD)的mRNA和蛋白表达水平;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测细胞上清液白细胞介素-1β(IL-1β)含量;双荧光素酶报告基因实验明确miR-520c-3p和TXNIP之间的相互作用。两组间比较采用t检验, 多组间比较采用单因素方差分析。结果与对照组相比, DKD组肾脏组织肾小管炎性细胞增多, 伴随miR-520c-3p表达水平下降, TXNIP表达升高(均P<0.05);肾小管特异性标志物水通道蛋白1(AQP1)与NLRP3和GSDMD焦亡蛋白共定位均增加。在HK-2细胞中, 与NG组相比, HG组焦亡细胞增多, 伴随miR-520c-3p表达水平下降, TXNIP、NLRP3、cl-caspase-1、GSDMD的蛋白水平和细胞上清液IL-1β浓度升高(均P<0.05);与模拟物对照组相比, 模拟物组中miR-520c-3p表达量更高, TXNIP mRNA表达量更低, TXNIP、NLRP3、cl-caspase-1、GSDMD的蛋白水平和IL-1β浓度更低(均P<0.01), TXNIP和NLRP3共表达定位减少(P<0.05);与抑制物对照组相比, 抑制物组中miR-520c-3p表达量更低, TXNIP mRNA表达量更高, TXNIP、NLRP3、cl-caspase-1、GSDMD的蛋白水平和IL-1β浓度更高(均P<0.01)。与共转染阴性对照组相比, 模拟物+TXNIP共转染组的TXNIP和NLRP3共表达定位增加, TXNIP、NLRP3、cl-caspase-1、GSDMD的蛋白水平更高(P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验表明, TXNIP是miR-520c-3p直接作用靶点, miR-520c-3p通过靶向调节TXNIP表达, 抑制高糖诱导的细胞焦亡。结论 miR-520c-3p通过抑制TXNIP/NLRP3途径减轻高糖诱导的近端肾小管上皮细胞焦亡。
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