耐药基因bla_(TEM-1)、bla_(IMP-3)、fosA3多重重组聚合酶扩增(RPA)快速检测方法的建立和应用

作者：朱凝瑜; 贺泽; 梁倩蓉; 郑晓叶; 丁雪燕^*; 曲道峰^*

来源：中国兽医学报, 2022, 42(05): 956-961.

DOI：10.16303/j.cnki.1005-4545.2022.05.18

• 多重重组酶聚合酶扩增
• 快速检测
• 耐药基因

为了建立同时检测多种耐药基因的快速检测方法，本研究以bla_(TEM-1)、bla_(IMP-3)、fosA3基因保守序列设计特异性引物，经优化反应条件，建立恒温检测上述3种耐药基因的多重重组聚合酶扩增(RPA)方法。条件优化结果显示，所建立的RPA方法在引物浓度为480 mmol/L,37℃恒温反应20 min时检测效果最佳。该方法对携带bla_(TEM-1)、bla_(IMP-3)、fosA3基因的菌株能扩增出条带，阴性菌株无条带，特异性高；对bla_(TEM-1)、bla_(IMP-3)基因的最低检出限为1.8×10~1拷贝/μL,对fosA3基因的最低检出限为1.8×10~2拷贝/μL,敏感性较强。用多重RPA方法对浙江省内水产养殖环境及生物体中分离到的400株菌株进行检测，养殖用水分离菌株的bla_(TEM-1)、bla_(IMP-3)和fosA3检出率分别为81.00%(81/100),11.00%(11/100)和29.00%(29/100);水产动物体内分离菌株的bla_(TEM-1)、bla_(IMP-3)和fosA3检出率分别为73.67%(221/300),1.33%(4/300)和23.33%(70/300),与常规PCR基本一致。建立的RPA方法操作简单、反应快速、检测限低、结果可靠，适用于多种耐药基因的快速检测，为快速摸清养殖产业链各环节的耐药基因谱，减少耐药基因传播，保障食品安全提供了技术支撑。

• 单位
  浙江工商大学; 浙江省食品安全重点实验室; 食品与生物工程学院; 浙江省水产技术推广总站